Дипломная работа: Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов

Осеменение коров-доноров проводилось двукратно двойной дозой замороженно-оттаянной спермы с содержанием не менее 25 млн. активных спермиев (рис. 1). Из спермодозы готовили мазки для определения патологических форм спермиев. Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали гематоксилином Караччи. Сперму, содержащую 18% и более патологических спермиев, выбраковывали, так как высокий процент патологических спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы.

Рис. 1. Нормальные спермии быка

Рис. 2. Патологические формы спермиев

Рис. 3. Патологические формы спермиев

Рис. 4. Патологические формы спермиев

Для бактериологических исследований использовали мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Китт-Тароцци, Сабуро и Булира, агар Эндо.

МПА и МПБ использовали для культивирования различных микроорганизмов неопределенного состава.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали среду Китт-Тароцци (МППБ).

Среду Булира и агар Эндо применяли для культивирования кишечной палочки.

Для выращивания грибов использовали среду Сабуро.

Все среды перед бактериологическим исследованием разливали в пробирки по 5 мл. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали автоклавированием при температуре 120°С в течение 15–30 минут. МПА после стерилизации скашивали, установив пробирки в наклонном положении до застывания среды.

Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках разливали по 20–25 мл и оставляли на несколько минут до застывания агара. Когда требовалось вырастить микроорганизмы на агарезированной среде в виде изолированных колоний, чашки после засева помещали в термостат дном вверх.

Отбор проб для бактериологических исследований проводили на всех этапах подготовки эмбрионов к трансплантации.

2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами

В помещениях лаборатории, где подготавливали инструменты, оборудование, посуду, среды для получения, пересадки и криоконсервации эмбрионов, ежедневно проводили влажную уборку.

Все оборудование бокса, его стены, пол не реже одного раза в неделю мыли моющими средствами и протирали дезинфицирующими растворами. Для дезинфекции использовали 2%-й раствор хлорамина «Б». Перед работой бокс и другие помещения лаборатории облучали в течение 40–60 минут ультрафиолетовыми лучами из расчета 2–3 вт/м.

В боксе в день работы с эмбрионами проводили дополнительную обработку столов и оборудования 96° этанолом.

Все сотрудники лаборатории работали в стерильных халатах и сменной обуви. Спецодежду (халаты, косынки, шапочки, марлевые повязки) стирали не реже одного раза в неделю с обязательным кипячением и проглаживанием утюгом. Обувь регулярно по окончании работы мыли и обеззараживали 2%-м раствором хлорамина.

Употребляемые для работы с эмбрионами инструменты, посуду стерилизовали различными способами в зависимости от материала, из которого они изготовлены.

Стеклянную посуду (флаконы, колбы, пипетки, цилиндры и пр.), а также инструменты для пересадки эмбрионов закрывали пергаментной бумагой и стерилизовали автоклавированием при 1,5 атм. в течение 30 мин. Затем сушили при температуре 80°С в течение 60 минут.

Шприцы, иглы, пинцеты, ножницы, влагалищные зеркала и системы для вымывания эмбрионов стерилизовали кипячением в течение 30 минут.

Перед стерилизацией новую стеклянную посуду мыли водопроводной водой с мылом или порошком, с помощью щеток и ершей, ополаскивали и погружали в раствор соляной кислоты (1 ст. ложка соляной кислоты на 3 литра дистиллированной воды) и выдерживали в нем 24 часа. После чего посуду отмывали в проточной воде, а затем многократно в би- и тридистиллированной воде и высушивали.

Бывшую в употреблении стеклянную посуду мыли в горячем 2–3% растворе двууглекислой соды, затем тщательноополаскивали водопроводной водой, после чего би- и тридистиллированной водой и высушивали.

Бывшие в употреблении металлические предметы также мыли в вышеуказанном растворе соды, ополаскивали водопроводной, би- и тридистиллированной водой и высушивали.

Одноразовые полимерные инструменты (ампулы, чехлы, пипетки и др.) стерилизовали в боксе путем их облучения бактерицидными лампами БУФ‑30 или ПРК‑2 в течение 20 мин. с обеих сторон на расстоянии 20 см от источника облучения.

Резиновые инструменты (катетер для вымывания) обрабатывали 70°С спиртом-ректификатом. Наружную поверхность стерилизовали, облучая лампами БУФ‑30 в течение 20 мин. на расстоянии 20 см от источника ультрафиолетовых лучей, перед работой ополаскивали 2–3 раза средой Дюльбекко.

4.2.2 Подготовка доноров и реципиентов

Подготовку донора начинали в манеже с чистки и мытья кожного покрова и конечностей. Затем животное переводили в операционную, фиксировали в станке, прямую кишку освобождали от содержимого. Для снятия напряжения прямой кишки проводили эпидуральную анестезию 2%-ым раствором новокаина в дозе 5 мл. По инструкции наружные половые органы и перенеальную область тщательно мыли водой с мылом, осушали салфеткой, дезинфицировали аэрозолем «Септонекс» или 70°-м этанолом. В опытах, корень хвоста, область промежности и наружные половые органы тщательно мыли теплой водой с мылом, осушали ватным тампоном. Кожу наружных половых органов и половые пути (преддверие влагалища, влагалище и влагалищную часть шейки матки) орошали раствором Люголя. Для этой цели хвост отводили в сторону вперед, фиксировали его при помощи веревки за переднюю перегородку станка. Во влагалище вводили подготовленное влагалищное зеркало. Через открытое зеркало орошали слизистые оболочки половых путей раствором Люголя. Через 15 минут после санации половых путей проводили извлечение эмбрионов.

Подготовку реципиентов к пересадке эмбрионов осуществляли также, как и подготовку доноров для нехирургического извлечения зародышей. Для предотвращения заноса микрофлоры в матку реципиента проводили санацию половых путей раствором Люголя за 15 мин. до пересадки эмбрионов.

Приготовление раствора Люголя.

Раствор Люголя готовили по следующей прописи:

кристаллический йод – 1,0 г

йодистый калий – 2,0 г

дистиллированная вода – 300,0 мл.

2,0 г йодистого калия растворяли в 100 мл воды, добавляли 1,0 г кристаллического йода и ставили на 10–12 часов в термостат до полного растворения йода. При этом йод растворяется в йодистом калии. Раствор переливали в большую мерную склянку и доводили общий объем до 300,0 мл. Затем его фильтровали и хранили во флаконах из темного стекла. Раствор использовали не более 30 дней.

4.2.3 Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке

Извлечение эмбрионов проводили на 7-8 день полового цикла нехирургическим методом. Перед операцией донора готовили по методике, описанной в разделе 1.2, затем эпидурально вводили 5–7 мл 2%-го новокаина в зависимости от веса животного. Беспокойным добавочно вводили 0,3–0,5 мл ромпуна. Ректально методом пальпации оценивали состояние полового аппарата, проводили подсчеты желтых тел и фолликулов. Для вымывания эмбрионов использовали катетеры различных конструкций. Промывная жидкость подавалась через закрытую систему самотеком из емкости, расположенной в верхнем гнезде штатива над донором. Промывание маточного рога проводили 8–10 раз, вводя по 60–50 мл промывной среды. На вымывание одного рога расходовали 450–500 мл модифицированной среды Дюльбекко с добавлением 1% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота.

В научно-производственных опытах по санации промывных буферных сред добавляли комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрациях 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, соответственно. Бактерицидную дозу санирующих препаратов испытывали на штаммах микроорганизмов, как монокультуре, так и в ассоциации, методом серийных разведении. Безвредность санирующих препаратов для эмбрионов определяли методом культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в средах содержащих различные дозы испытуемых препаратов.

Эффективность применения санирующих препаратов учитывали по результатам приживляемости эмбрионов.

Смыв отстаивали 15–20 мин. при температуре 37°С в термостате. Надосадочную жидкость аспирировали с помощью сифона. Осадочную среду разливали в стерильные чашки Петри с расчерченным на полоски дном. Поиск зародышей производили под стереоскопическим микроскопом МБС-9.

Обнаруженные эмбрионы переносили стерильным микрошприцем на малую чашку Петри диаметром 40 мм. Жизнеспособность эмбрионов определяли по общепринятой методике оценки морфологического состояния эмбриона (В. Shea et al., 1976), учитывая их компактность, симметричность, плотность. (Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, 1987).

В сравнительных опытах по многократному отмыванию эмбрионов использовали буферные среды, приготовленные за 10–15 мин. до начала поиска эмбрионов. Отмывная среда для эмбрионов состояла из стерильного буфера Дюльбекко с добавлением 15–20% инактивированной фетальной сыворотки, которую в стерильных условиях расфасовывали в полиэтиленовые ампулы по 2 мл. В другой емкости готовили такую же среду с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл). При отмывании использовали микрошприц и микропипетку для захвата эмбрионов с минимальным объемом среды. Устройство применяли с целью захвата, переноса и микробной деконтаминации эмбрионов.

Культивирование эмбрионов проводили при температуре 37,5°С без доступа кислорода в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

В среду для культивирования подопытных эмбрионов вносили комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл), в первом контроле использовали пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (50 Ед/мл), во втором контроле для культивирования эмбрионов использовали среду без антибиотиков.

Эмбрионы в средах с антибиотиками выдерживали 2 часа. Затем меняли среду и культивировали 72 часа. Морфологическое состояние эмбрионов оценивали через 2, 24, 48 и 72 часа.

4.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов

При проведении опытов по определению влияния микробного фактора на приживляемость эмбрионов использовали чистые культуры микроорганизмов, ранее выделенные из половых путей коров-доноров и телок-реципиентов. Инокуляцию отмытых и подготовленных к пересадке эмбрионов проводили чистыми суточными культурами. Чистые культуры Stapha и Ecoli выделяли методом Коха. Принцип метода заключается в получении чистой культуры из колонии, рост которой считали результатом развития одной клетки.

Для выделения чистой культуры производили высев на поверхность агаровой среды из накопительной культуры (с ее разведения). Разведение делали с таким расчетом, чтобы получить на поверхности агаровой среды изолированные колонии. Для посева на поверхность плотной агаровой среды наносили каплю этой культуры, которую осторожно распределяли по всей поверхности стерильным шпателем с последующим переносом ее на поверхность агара последовательно во вторую, третью и четвертую чашки. В первых двух чашках после инкубации при температуре 37°С для Staph. aureus и 43 «С для E.coli наблюдали «сплошной» рост микроорганизмов, тогда как в последующих чашках отмечали рост изолированных колоний. Одну из колоний отбирали стерильной петлей и производили высевы в пробирки с МПБ и на поверхность скошенного агара. Идентификацию E.coli проводили путем высева на среду Булира и Эндо, a Staph. aureus на МПБ и МПА с добавлением 1% глюкозы.

Чистые культуры Staphaureus и Е. coli в разведении 1:10 контаминировали в среды с эмбрионами.

Для получения определенного количества микроорганизмов в 1 мл среды необходимо было получить суспензию этих культур и приготовить их разведение. Чаще всего для инокуляции используют чистые суточные культуры микроорганизмов в разведении 1:10 – 1:10. Для приготовления таких разведении, стерильный физиологический раствор разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исходной суспензии, взятой стерильной пипеткой, переносили в первую пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора – получали первое разведение 1:10. Затем этой же пипеткой брали 1 мл полученного разведения и переносили его во вторую пробирку. Получали второе разведение

Таким же образом готовили и последующие разведения.

В эксперименте по определению влияния микробного факторана приживляемость эмбрионов было взято две группы животных-аналогов по 20 голов в каждой. Телкам-реципиентам опытных групп пересаживали эмбрионы, инокулированные чистыми культурами микроорганизмов в вышеуказанных разведениях. 10 животным трансплантировали эмбрионы, инфицированные Staph. aureus, другим 10 – эмбрионы с внесенной культурой E.coli, 20 контрольным телкам пересаживали эмбрионы, отмытые в пяти чашках стерильными буферными средами, без добавления микроорганизмов.

В природе отмечено, что микроорганизмы в ассоциациях могут быть синергистами либо антагонистами. Поэтому нами проведены исследования по определению антагонизма микроорганизмов, выделенных из половых путей самок. В этих опытах применяли метод посева испытуемых микробов на чашках Петри с МПА радиальными штрихами к предварительно выращенным колониям предполагаемого антагониста по методике В.В. Аврех и А.Ф. Зак, описанной в справочнике И.О. Биргера (1973).

В экспериментах по определению бактериальной загрязненности половых путей доноров и реципиентов нами выделено в основном 4 вида бактерий: Bac.subtilis, E.coli, Staph.aureus и Ps.aeruginosa. Перечисленные виды микроорганизмов относятся к группе возбудителей специфических половых инфекций. Известно, что в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качественный состав микрофлоры изменяется или активизируется деятельность имеющихся микроорганизмов.

Попадание микробов в глубокие отделы полового аппарата самки в природных условиях при естественном спаривании явление не столь уж редкое. Именно вследствие этого возникла у самок активная защитная реакция в эстральном периоде. И у самих зародышей в процессе эволюции выработался защитный механизм, особенно необходимый на ранних стадиях развития, когда еще не существует плацента с ее барьерной функцией. Это подтверждено опытами Б.П. Токина(1956).

4.3 Анализ экономической деятельности предприятия

Таблица 4.3.1. Анализ фонда заработной платы Харьковского биотехнологического центра

Анализ фонда заработной платы показал, что в биоцентре работают 50 человек, из них специалисты – 38 человек.

Средняя заработная плата составляет 309,8 грн. Самая высокая оплата труда оказалась у специалистов.

Согласно КЗоТа Украины рабочий день не должен превышать 8 часов при 2 выходных днях в неделю. Следовательно, каждый рабочий за год, с учетом выходных и праздничных дней, отпуска в среднем отработал 257 дней.

257 дней * 8 часов * 50 человек = 102800 Чел. часов = 102,8 тыс. Чел. часов

Так, затраты труда в 2001 году по биоцентру составили 102,8 Чел.часов, что на 23,4% больше, чем в 2000 году. На данный показатель производительности труда повлияло расширение штата персонала центра, а также сокращение процентов рабочих мест по болезни.

Анализ финансового состояния биоцентра показал, что основным источником финансирования являются:

1. Украинская академия аграрных наук;

2. Министерство науки Украины;

3. Министерство аграрной политики Украины;

4. Различные организации и учреждения, пользующиеся услугами ХБТЦ;

Таблица 4.3.2. Финансовые поступления в ХБТЦ

Анализ таблицы 4.3.2 показал, что основным источником ХБТЦ является УААН. Так, в 2001 году в структуре финансирования на УААН приходилось 58,5% или 643,9 тыс. грн. Однако, динамика финансовых поступлений за 3 исследуемых года показала, что общая сумма финансирования в 2001 году возросла на 44,8% по сравнению с 1999 годом и составила 1100,7 тыс. грн. Данные таблицы показывают, что структура финансовых поступлений за три года существенно изменилась. Возросли прочие финансовые поступления с 7,8 до 25,4% и составили 279,6 тыс. грн. На данный показатель существенно повлияло увеличение оказания услуг посторонним организациям, т.е. биоцентр стремится быть финансово независимым от вышестоящих структур и пытается собственными силами обеспечить финансовую независимость. По нашему мнению целесообразно было бы данному учреждению организовать маркетинговый отдел, который бы занимался рекламной кампанией по пропаганде научных достижений и разработок биоцентра в ближнем и дальнем зарубежье, что позволит существенно увеличить финансовые поступления.

Таблица 4.3.3. Поступления ветеринарных препаратов, реактивов для научных исследований

Таблица 4.3.4. Анализ сметы предприятия

Анализ сметы организации показал, что затраты за исследуемый период увеличились на 19,2% и в 2001 году составили 925,7 тыс. грн. Основными статьями сметы – содержание основных средств 38,5%, материальные затраты – 25,7%. Так, увеличение численности работников повлекло и увеличение затрат на заработную плату, а также проведенные работы за 1999–2001 гг. по реконструкции, модернизации и совершенствованию основных средств организации повлекло и увеличение затрат на содержание и амортизационные отчисления. Анализ динамики сметы организации показал, что организация стремится к расширению своей деятельности, увеличивая количество предоставляемых услуг, работ, научных исследований. На перспективу развития необходимо увеличивать смету организации, так как на достигнутом уровне ХБТЦ не останавливается, а постоянно увеличивает спектр научных исследований, что способствует интеграции научных достижений ученых ХБТЦ с практическим их применением.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5