Биологическое окисление

белкового комплекса сама переносит протоны.

Действие разобщителей.

С 40-х годов известен ряд липофильных слабых кислот, способных

действовать как разобщающие агенты, т.е. нарушать сопряжение транспорта

электронов с синтезом АТФ. При добавлении к клеткам этих низкомолекулярных

органических соединений митохондрии прекращают синтез АТФ, продолжая при

этом поглощать кислород. В присутствии разобщающего агента, скорость

транспорта электронов остается высокой, но протонный градиент не создается.

Это простое объяснение этого эффекта: разобщающие агенты (например,

динитрофенол, тироксин) действуют как переносчики Н+ (Н+-ионофоры) и

открывают дополнительный путь - уже не через АТФ-синтетазу – для потока Н+

через внутреннюю митохондриальную мембрану.(13, 2000(

Дыхательный контроль.

Когда к клеткам добавляют разобщающий агент, например динитрофенол,

поглощение кислорода митохондриями значительно возрастает, так как скорость

переноса электронов увеличивается. Такое ускорение связано с

существованием дыхательного контроля. Полагают, что этот контроль основан

на прямом инги6ирующем влиянии электрохимического протонного градиента на

транспорт электронов. Когда в присутствии разобщителя

электрохимический градиент исчезает, не контролируемый более транспорт

электронов достигает максимальной скорости. Возрастание градиента

притормаживает дыхательную цепь, и транспорт электронов замедляется. Более

того, если в эксперименте искусственно создать на внутренней

мембране необычно высокий электрохимический градиент, то нормальный

транспорт электронов прекратится совсем, а на некоторых участках

дыхательной цепи можно будет обнаружить обратный поток электронов. Это

позволяет предполагать, что дыхательный контроль отражает простой баланс

между изменением свободной энергии при перемещении протонов, сопряженного с

транспортом электронов, и изменением свободной энергии при самом транспорте

электронов.Величина электрохимического градиента влияет как на скорость,

так и на направление переноса электронов, так же как и на направление

действия АТФ-синтетазы.

Дыхательный контроль - это лишь часть сложной системы взаимосвязанных

регуляторных механизмов с обратными связями, координирующей скорости

гликолиза, расщепления жирных кислот, реакций цикла лимонной кислоты и

транспорта электронов. Скорости всех этих процессов зависят от отношения

АТФ:AДФ - они возрастают, когда это отношением уменьшается в результате

усиленного использования АТФ. Например, АТФ-синтетаза внутренней

митохондриальной мембраны работает быстрее, когда концентрации ее

субстратов, т. е. .AДФ и Фн, увеличиваются. Чем выше скорость этой реакции,

тем больше протонов перетекает в матрикс, быстрее рассеивая тем самым

электрохимический градиент; а уменьшение градиента в свою очередь приводит

к ускорению транспорта электронов.[1,1994]

Митохондрии бурой жировой ткани – генераторы тепла.

Всем позвоночным в молодом возрасте для образования тепла, в дополнение к

механизму мышечного тремора, необходимо термогенное устройство. Такого рода

устройство особенно важно для животных, впадающих в зимнюю спячку. Мышцы в

состоянии тремора сокращаются и при отсутствии нагрузки, используя

сократительные белки для гидролиза АТФ обычным для мышечных клеток образом

и освобождая в виде тепла всю энергию, потенциально доступную при гидролизе

АТФ. Необходимость особого термогенного устройства определяется прочно

сопряженным окислительным фосфорилированием нормальных митохондрий. Если бы

этот процесс мог быть разобщен, как это бывает в присутствии динитрофенола,

он мог бы служить в качестве адекватного приспособления, производящего

тепло; именно так это происходит в митохондриях бурого жира. Хотя эти

митохондрий обладают обычной обратимой АТФазой, в них имеется также

трансмембранная протонная транслоказа, посредством которой протоны могут

возвращаться в матрикс и электрически шунтировать работу АТФазы. Если этот

процесс достаточен для того, чтобы поддерживать окислительно-

восстановительный потенциал водорода значительно ниже 200 мВ, синтез АТФ

становится невозможным и окислительный процесс протекает свободно, в

результате чего вся энергия освобождается в виде тепла.[2, 1994]

Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса).

Цикл лимонной кислоты представляет собой серию реакций, протекающих в

митохондриях, в ходе которых осуществляется катаболизм ацетильных групп и

высвобождение водородных эквивалентов; при окислении последних

поставляется свободная энергия топливных ресурсов тканей. Ацетильные группы

находятся в составе ацетил-КоА (активного ацетата), тиоэфира кофермента А.

Главная функция цикла лимонной кислоты состоит в том, что он является

общим конечным путем окисления углеводов, белков и жиров, поскольку в ходе

метаболизма глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты превращаются либо в

ацетил-СоА, либо в промежуточные соединения цикла. Цикл лимонной кислоты

играет также главную роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования,

дезаминирования и липогенеза, Хотя ряд этих процессов протекает во многих

тканях, печень - единственный орган, в котором идут все перечисленные

процессы. Поэтому серьезные последствия вызывает повреждение большого числа

клеток печени или замещение их соединительной тканью. О жизненно важной

роли цикла лимонной кислоты свидетельствует и тот факт, что у человека

почти не известны генетические изменения ферментов, катализирующих реакции

цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным

развитием.[10,1993]

Открытие ЦТК.

Впервые предположение о существовании такого цикла для окисления

пирувата в животных тканях было высказано в 1937 году Гансом Кребсом. Эта

идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных

органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями

измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пирувата.

Грудные мышцы отличаются чрезвычайно высокой интенсивностью

дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной

активности. Кребс также подтвердил, что обнаруженные ранее в животных

тканях другие органические кислоты (янтарная, яблочная, фумаровая и

щавелевоуксусная) стимулируют окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что

окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными

трикарбоновыми кислотами - лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также

пятиуглеродной (-кетоглутаровой кислотой. Испытаны были и некоторые другие

встречающиеся в природе органические кислоты, но ни одна из них не

обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер

стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из

них было достаточно для того, чтобы вызвать окисление во много раз большего

количества пирувата.[9, 1991]

Простые эксперименты, а также логические рассуждения позволили Кребсу

высказать предположение, что цикл, который он назвал циклом лимонной

кислоты, является главным путем окисления углеводов в мышце. После, цикл

лимонной кислоты был обнаружен практически во всех тканях высших животных и

растений и у многих аэробных микроорганизмов. За это важное открытие Кребс

был удостоен в 1953 году Нобелевской премии. Юджин Кеннеди и Альберт

Ленинджер показали позднее, что все реакции цикла лимонной кислоты

протекают в митохондриях животных клеток. В изолированных митохондриях

печени крысы были обнаружены не только все ферменты и коферменты цикла

лимонной кислоты; здесь же, как выяснилось, локализованы все ферменты и

белки, которые требуются для последней стадии дыхания, т.е. для переноса

электронов и окислительного фосфорилирования. Поэтому митохондрии с полным

правом называют «силовыми станциями» клетки.

Катаболическая роль цикла лимонной кислоты

Цикл начинается со взаимодействия молекулы ацетил-СоА с

щавелевоуксусной кислотой (оксалоацетатом), в результате которого

образуется шестиуглеродная трикарбоновая кислота, называемая лимонной.

Далее следует серия реакций, в ходе которых происходит высвобождение двух

молекул С02 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество

оксалоацетата, необходимое для превращения большого числа ацетильных единиц

в С02, весьма невелико, можно считать, что оксалоацетат выполняет

каталитическую роль.

Цикл лимонной кислоты является механизмом, обеспечивающим улавливание

большей части свободной энергии, освобождаемой в процессе окисления

углеводов, липидов и белков. В процессе окисления ацетил-СоА благодаря

активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образование

восстановительных эквивалентов в форме водорода или электронов. Последние

поступают в дыхательную цепь; при функционировании этой цепи

происходит окислительное фосфорилирование, то есть синтезируется АТФ.

Ферменты цикла лимонной кислоты локализованы в митохондриальном

матриксе, где они находятся либо в свободном состоянии, либо на внутренней

поверхности внутренней митохондриальной мембраны; в последнем случае

облегчается перенос восстановительных эквивалентов на ферменты

дыхательной цепи, локализованные во внутренней митохондриальной

мембране.[11, 1989]

Реакции ЦТК.

Начальная реакция - конденсация ацетил-СоА и оксалоацетата,

катализируется конденсирующим ферментом, цитратсинтетазой, при этом

происходит образование связи углерод-углерод между метальным углеродом

ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации,

приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной связи,

сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме

теплоты; это определяет протекание реакции слева на право до ее завершения:

Ацетил-СоА + Оксалоацетат + Н2О > Цитрат + CoA-SH

Превращение цитрата в изоцитрат катализируется аконитазой, содержащей

железо в двухвалентном состоянии. Эта реакция осуществляется в две стадии:

сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его

остается в комплексе с ферментом), а затем - гидратация и образование

изоцитрата:

Цитрат ? цис -Аконитат ? Изоцитрат – Н2О

Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во

фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя

фторцитрат. Непосредственным ингибитором аконитазы является

фторцитрат, при ингибировании накапливается цитрат.

Эксперименты с использованием промежуточных соединений показывают,

что аконитаза взаимодействует с цитратом ассиметрично: она всегда действует

на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата.

Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между

цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути.

Далее изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрогенирование с

образованием оксалосукцината. Описаны три различных формы

изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, НАД-зависимая, найдена только в

митохондриях. Две другие формы являются НАДФ-зависимыми, причем одна из них

также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата,

связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно

НАД-зависимым ферментом:

Изоцитрат + НАД+ ? Оксалосукцинат (в комплексе с ферментом) ?

альфакетоглутарат + СО2+ НАДН2

Рисунок 5. Реакции цикла Кребса.[10,1993]

Далее следует декарбоксилирование с образованием

альфакетоглутарата, которое также катализируется

изоцитратдегидрогеназой. Важным компонентом реакции

декарбоксилирования являются ионы Mg2+ (или Мn2+). Судя по имеющимся

данным, оксалосукцинат, образующийся на промежуточной стадии реакции,

остается в комплексе с ферментом.

Альфакетоглутарат, в свою очередь, подвергается окислительному

декарбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием

пирувата: в обоих случаях субстратом является альфакетокислота. Реакция

катализируется альфакетоглутаратдегидрогеназным комплексом и требует

участия того же набора кофакторов - тиаминдифосфата, липоата, НАД+, ФАД и

СоА; в результате образуется сукцинил-СоА - тиоэфир, содержащий

высокоэнергетическую связь.

?-кетоглуторат + НАД+ + CoA-SH > Сукцинил-СоА + СО2 + НАДН+Н+

Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования

сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и

при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к

накоплению субстрата (альфакетоглутарат).

Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат,

катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой):

Сукцинил-СоА + ФН + ГДФ? Сукцинат + ГТФ + CoA-SH

Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в

присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это -

единственная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется

высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при

окислительном декарбоксилировании ?-кетоглутарата потенциальное количество

свободной энергии достаточно для образования НАДН и высокоэнергетической

фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может

образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ. Например:

ГТФ+АДФ (ГДФ+АТФ.

В альтернативной реакции, протекающей во внепеченочных тканях и

катализируемой сукцинил-СоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой, сукцинил-СоА

превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в

ацетоацетил-СоА. Впечени имеется диацилазная активность,

обеспечивающая гидролиз части сукцинил-СоА с образованием сукцината и СоА.

Далее сукцинат дегидрогенируется, затем присоединяется молекула воды, и

следует еще одна стадия дегидрогенирования, приводящая к регенерации

оксалоацетата:

Сукцинат + ФАД ( Фумарат + ФАДН2

Первое дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой,

связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны.

Это единственная дегидрогеназная реакция ЦТК, в ходе которой осуществляется

прямой перенос с субстрата на флавопротеин без участия НАД+. Фермент

содержит ФАД и железо-серный белок. В результате дегидрогенирования

образуется фумарат. Как показали эксперименты с использованием изотопов,

фермент стереоспецифичен к транс-атомам водорода метиленовых групп

сукцината. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует

сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.

Фумараза (фумаратгидротаза) катализирует присоединение воды к фумарату

с образованием малата:

Фумарат +Н2О ( L-малат

Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоединение

компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транс-конфигурации.

Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата в оксалоацетат, реакция

идет с участием НАД+:

L-малат + НАД+ ( 0ксалоацетат + НАДН2

Хотя равновесие этой реакции сильно сдвинуто в направлении малата,

реально она протекает в направлении оксалоацетата, поскольку он вместе с

НАДН постоянно потребляется в других реакциях.

Ферменты цикла лимонной кислоты, за исключением

альфакетоглутарат- и сукцинатдегидрогеназы, обнаруживаются и вне

митохондрий. Однако некоторые из этих ферментов (например,

малатдегидрогеназа) отличаются от соответствующих митохондриальных

ферментов.

Энергетика цикла лимонной кислоты.

В результате окисления, катализируемого дегидрогеназами ЦТК, на каждую

катаболизируемую за период одного цикла молекулу ацетил-СоА образуются три

молекулы НАДН и одна молекула ФАДН2. Эти восстановительные эквиваленты

передаются в дыхательную цепь, локализованную в митохондриальной мембране.

При прохождении по цепи восстановительные эквиваленты НАДН

генерируют три высокоэнергетические фосфатные связи посредством

образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. За счет

ФАДН2 генерируется только две высокоэнергетические фосфатные связи,

поскольку ФАДН2 переносит восстановительные эквиваленты на кофермент Q и,

следовательно, в обход первого участка цепи окислительного

фосфорилирования в дыхательной цепи. Еще один высокоэнергетический фосфат

генерируется на одном из участков цикла лимонной кислоты, то есть на

субстратном уровне, при превращении сукцинил-СоА в сукцинат. Таким образом,

за период каждого цикла образуется 12 новых

высокоэнергетических фосфатных связей.

Регуляция цикла лимонной кислоты.

Основные процессы, которые поставляют и запасают энергию в клетках,

могут быть в общей форме изображены следующим образом:

глюкоза пируват ( ацетил-СоА жирные кислоты

AДФ

АТФ

С02

Регуляция этой системы inter alia должна гарантировать постоянное

поступление АТФ соразмерно с существующими в данный момент энергетическими

потребностями, обеспечивать превращение избытка углеводов в жирные кислоты

через пируват и ацетил-СоА и наряду с этим контролировать экономное

расходование жирных кислот через ацетил-СоА как ключевой продукт для входа

в цикл лимонной кислоты.

Цикл лимонной кислоты поставляет электроны в электронпереносящую

систему, в которой поток электронов сопряжен с синтезом АТФ и в меньшей

степени снабжает восстановительными эквивалентами системы биосинтеза

промежуточных продуктов. В принципе цикл не может протекать быстрее, чем

это позволяет использование образуемой АТФ. Если бы весь AДФ клетки

превратился в АТФ , не могло бы быть никакого дальнейшего потока электронов

от НАДH, который накапливается, к 02. Ввиду отсутствия НAД+, необходимого

участника процессов дегидрирования цикла, последний перестал бы

функционировать. Существуют более тонкие регуляторные приспособления,

которые модулируют действие ферментов в самом цикле лимонной кислоты.

Сукцинатдегидрогеназа находится во внутренней митохондриальной

мембране. Все остальные ферменты растворены в матриксе, заполняющем

внутреннее пространство митохондрии. Измерения относительных количеств этих

ферментов и концентраций их субстратов в митохондриях указывают, что каждая

реакция протекает с одинаковой скоростью. Как только пируват (или другой

потенциальный источник ацетил-СоА) поступает внутрь матрикса митохондрии,

весь цикл протекает внутри этого отсека.

В некоторых участках стимуляция или ингибирование определяется

относительными концентрациями НAДH/НAД, ATФ/AДФ или АМФ, ацетил-СоА/СоА или

сукцинил-СоА/СоА. Когда эти отношения высоки, клетка достаточно обеспечена

энергией и поток через цикл замедлен; когда же они низки, клетка испытывает

потребность в энергии, и поток через цикл ускоряется.

Как необратимая реакция, соединяющая метаболизм углеводов с циклом

лимонной кислоты, пируватдегидрогеназная реакция должна хорошо

контролироваться. Это достигается двумя способами. Во-первых, фермент,

который активируется несколькими интермедиаторами гликолиза,

конкурентно ингибируется своими собственными продуктами - НAДH и ацетил-

СоА. При прочих равных условиях увеличение соотношения НAДH/НAД+ от 1 до 3

вызывает 90%-е снижение скорости реакции, а увеличение отношения ацетил-

СоА/СоА приводит к количественно подобному эффекту. Эффект проявляется

мгновенно. Медленнее возникают, но дольше действуют эффекты другого

регуляторного устройства. С сердцевиной каждой молекулы

дигидролипоилтрансацетилазы связано около пяти молекул киназы

пируватдегидрогеназы, которая за счет АТФ катализирует фосфорилирование

серинового остатка в (-цепи пируватдегидрогеназного компонента.

Будучи фосфорилирован, фермент не способен декарбоксилировать пируват.

Когда происходит окисление жирных кислот, пируватдегидрогеназа заметно

ингибируется. По-видимому, это явление объясняется сопутствующими

процессу окисления высокими концентрациями АТФ, ацетил-СоА и НAДH.

Большинство тканей содержат избыток пируватдегидрогеназы, так что после

приема корма в печени, а также в мышце и в жировой ткани у животных в

состоянии покоя лишь 40, 15 и 10% пируватдегидрогеназы соответственно

находится в активной, нефосфорилированной форме. Когда возрастает

потребность в АТФ, концентрации НAД+, СоА и AДФ возрастают за счет

использования НAДH, ацетил-СоА и АТФ, а киназа инактивируется. Однако

фосфатаза продолжает функционировать вновь активируя дегидрогеназу.

Повышение Са2+ может активировать митохондриальную фосфатазу.

Синтез цитрата - стадия, лимитирующая скорость цикла лимонной кислоты.

Регуляция этой стадии совершается благодаря небольшому, но достаточно

значимому ингибированию цитрат-синтетазы посредством НAДH и сукцинил-СоА.

Основное же влияние на скорость синтеза цитрата оказывает поступление

субстрата.

Активность изоцитратдегидрогеназы регулируется в зависимости от

концентраций Mg2+, изоцитрата, НAД+, НAДH и АМФ. Кроме

субстратсвязывающих центров для НAД+, изоцитрата и Mg2+ фермент имеет еще и

положительные, и отрицательные эффекторные участки. Изоцитрат -

положительный эффектор; его связывание кооперативно, т. е. связывание на

Страницы: 1, 2, 3, 4