Актинобациллезная (гемофилезная)

работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды

с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8(С.

Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры,

выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии.

2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД--зависимых бактерий,

выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и

генетическим свойствам.

Исследование ферментативных свойств НАД – и гемин – зависимых культур

бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с

добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в

микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ.

Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в

ПБДЭ и микрообъёмах.

Таксономическое положение 165 культур НАД--зависимых бактерий,

выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями

фибриозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов,

было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в

данную коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.parainfluenzae,

H.influenzae, A.ligieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были

определены 57 фенотипических признаков, характеризующих их культуральные и

ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в

числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу свиноводства конечным

представлением полученных результатов в виде дендрограммы.

Анализ дендрограммы показал, что все культуры объединяются в единый

массив при уровне сходства 75,02%, после чего они подразделяются на два

больших фенона: один с уровнем сходства 81,87%, включающий типовые штаммы

A.lignieresii, A.suis, Haemophilus, (Actinobacillus), pleuropneumoniae и

типовой штамм «малой группы» (фенон «А»), второй с уровнем подобия 81,997%

включает типовые штаммы H.influenzae, H.parainfluenzae и H.parasuis (фенон

«Н»). Из фенона «А», объединяющего культуры актинобацилл на уровне подобия

91,23%, выделяется фенон №1, включающий виды A.lignieresii и A.suis, и на

уровне сходства 95,00% выделяется фенон №2, объединяющий эпизоотические

культуры вокруг типового штамма «малой группы». При уровне подобия 89,48%

формируется фенон №3, объединяющий эпизоотические штаммы вокруг типовых

культур Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

В феноне «Н» на уровне сходства 81,997% выделяется фенон №4-

-H.influenzae, на уровне 87,63% - фенон №5, объединяющий штаммы

H.parainfluenzae и на уровне подобия 89,60% вокруг типовых штаммов

H.parasuis концентрируется другая группа эпизоотических штаммов -

-фенон №6.

Следовательно, массив эпизоотических штаммов дифференцируется на три

фенотипические группы, соответствующие видам Haemophilus (Actinobacillus)

pleuropneumoniae, H.parasuis и «малой группе» гемофильных бактерий.

Полученные данные свидетельствуют о тяготении культур Haemophilus

pleuropneumoniae не к роду Haemophilus, а к роду Actinobacillus.

С целью уточнения таксономического положения эпизоотических штаммов,

классифицированных по фенотипическим свойствам как Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД--зависимых бактерий, обозначаемых

как Pasteurella-haemolytica- подобные бактерии, был определён нуклеотидный

состав и уровень гомологии ДНК культур этих групп свиноводства

представителями рода Haemophilus (H.parasuis, шт.J 95-таксон «С»),

Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), а также с типовыми

культурами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

Результаты показали, что все исследованные штаммы по ГЦ -составу

образуют довольно однородную группу свиноводства крайними значениями 39,8 -

43,2 ([pic]=41,3(0,2). Такие значения вполне соответствуют приводимым в

Руководстве Берги для семейства Pasteurellaceae. Несколько более высокий ГЦ

состава обнаружен у P.haemolytica - подобных бактерий (42,5(0,5) по

сравнению с типовыми штаммами A.pleuropneumoniae, (40,7(0,5).

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae имели

показатель 41,2(0,1 мол% ГЦ.

Уровень гомологии ДНК внутри группы P.haemolytica - подобных штаммов

составил 100%; ДНК бактерий этой группы (шт.2288/77) имела гомологию с ДНК

типовых штаммов A.pleuropneumoniae - 75%; с ДНК A.suis - 33%, с ДНК

P.multocida и H.parasuis не более 9%; с ДНК эпизоотических штаммов

Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae - 75—83%.

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae

по данным гибридизации ДНК образуют генетически взаимосвязанную группу с

уровнем подобия нуклеотидных последовательностей – 75-100%. В то же время

бактерии этой группы тесно связаны с типовыми штаммами Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae (78-98%), на уровне 33-38% гомологичных

нуклеоидных последовательностей с ДНК A.suis , и только на уровне гомологии

ДНК 5-9% с H.parasuis и 3-10% c P.multocida.

При интерпретации полученных результатов мы исходили из критериев

генетического анализа, предложенных Медниковым и соавт.(1974), согласно

которым культуры P.haemolytica - подобных бактерий не имеющие

НАД—зависимости, могут рассматриваться как биовар Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae. В целом эпизоотические штаммы,

выделенные при фибринозно - геморрагических пневмониях, P.haemolytica -

подобные бактерии и типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus)

pleuropneumoniae предстают как видовая общность с заметной внутривидовой

гетерогенностью. Подобный внутривидовой уровень гетерогенности не исключает

выделения дополнительных внутривидовых таксонов, кроме НАД—зависимого и -

независимого биоваров.

Полученные данные свидетельствуют, что культуры A.pleuropneumoniae,

обозначаемые в 9-м издании Руководства по систематике бактерий Берги как

видов рода Haemophilus, не относятся к нему, а также штамм J95 (таксон

«С»), упоминаемый в числе видов рода Haemophilus, по данным гибридизации

также не относится к роду Haemophilus.

На основании результатов нумерического анализа, с учётом частоты

встречаемости тех или иных положительных ферментативных реакций, для

идентификации НАД--зависимых бактерий, выделяемых при пневмониях и

генерализованных серозитах свиней, рекомендованы в качестве основных

дифференциальных признаков (кроме культуральных): НАД—зависимость,

образование уреазы, щелочной фосфатазы, гемолизина, кислоты из ксилозы,

маннита и маннозы. Остальные ферментативные признаки можно рассматривать

как дополнительные.

Потеря культурами A.pleuropneumoniae НАД—зависимости и признание

существования НАД—независимого биовара этого вида бактерий делает

неприемлемой схему идентификации, предлагаемую для НАД--зависимых культур.

Неизбежно расширяется число бактериальных видов, от которых необходимо

дифференцировать НАД - независимые культуры A.pleuropneumoniae. Ситуация

осложняется тем, что сходные патологоанатомические изменения в лёгких могут

вызвать другие виды бактерий. В опытах экспериментального (интраназального)

заражения свиней сходные изменения в легких были обнаружены при инокуляции

культур A.pleuropneumoniae НАД—зависимого и - независимого биоваров, A.suis

и бактерий «малой группы». Данное обстоятельство увеличивает значение

бактериологического исследования в диагностике болезни. Сравнительное

изучение физиологических свойств A.pleuropneumoniae (1 и 2 биовары),

A.suis, P.multocida и B.bronchiseptica как видов сходных и достаточно часто

обнаруживаемых при пневмониях свиней позволило нам отобрать для их

дифференциации следующий минимальный набор признаков: липкость колоний и

вязкость бульона, наличие капсулы и жгутиков, гемолитическая и уреазная

активность, образование щелочной фосфатазы, индола, кислоты из маннита,

сорбита, салицина, мелибиозы, утилизации цитратов.

3. Патогенные свойства A.pleuropneumoniae.

Исследовали патогенность данного вида бактерий для лабораторных

животных и свиней.

При испытаниях различных способов заражения морских свинок культурами

A.pleuropneumoniae животные этого вида оказались наиболее чувствительны

культур интраназальной инокуляции (ЛД50=125млн.м.к.), менее чувствительны –

к внутрибрюшинному (ЛД50=1,585 млрд.м.к.) и малочувствительны к подкожному

заражению. Сравнительная оценка вирулентности девяти штаммов

A.pleuropneumoniae при интраназальном способе инокуляции по критерию объёма

поражённой лёгочной ткани показала наибольшую вирулентность культур 1,4,5

сероваров и существенно меньшую у культуры серовара 3; культуры серовара 2

показали штаммовые различия. Патологоанатомические изменения при

интраназальном заражении морских свинок характеризовались развитием

фиброзно-геморрагической пневмонии.

В отличие от морских свинок белые мыши оказались более чувствительны

к внутрибрюшинному заражению: ЛД50 составила для культуры [pic] [pic] [pic]

изменения в лёгких у заражённых мышей характеризовались развитием

геморрагической пневмонии. Отличительной особенностью явилось практически

полное отсутствие отложений фибрина на плевре и перикарде. В целом

прослеживается видовые отличия изменений в лёгких при актинобациллёзной

пневмонии: в воспалительном экссудате максимальное количество фибрина

отмечается у свиней, меньше - у морских свинок и практически отсутствует у

мышей.

Полученные результаты свидетельствуют, что морские свинки и белые

мыши могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении

вирулентности штаммов возбудителя, вопросов пато - и иммуногенеза.

Испытание различных способов заражения 2-2,5 - месячных свиней

показало их чувствительность к интраназальному и трахеальному способам

введения возбудителя при устойчивости к подкожной инокуляции культур.

Заболевание удалось также воспроизвести контактным путем. При

интраназальном и трахеальном заражении (доза [pic]) инкубационный период

составил 3 - 6 часов, контактном - 72 часа. При всех способах заражения

однотипные изменения в виде фибринозно - геморрагической пневмонии отмечали

в лёгких. Это свидетельствует, что естественными входными воротами

возбудителя являются дыхательные пути.

При оценке патогенности для свиней культур возбудителя различных

сероваров (сер. 1,2,3,4,5) установили, что колебания вирулентности больше

отражают штаммовые различия или состояние культуры на момент исследования,

чем серовариантную принадлежность. Только культура серовара 3 в опытах на

свиньях и лабораторных животных закономерно показывала меньшую

вирулентность, чем штаммы других сероваров. Титрация культуры

эпизоотического штамма возбудителя на свиньях (интраназальное заражение)

показала ЛД50 на уровне [pic] м.к.

На результаты заражения свиней влияет возраст культуры бактерий. При

интраназальном заражении свиней одинаковой дозой 6 - и 18 - часовых культур

([pic]) инкубационный период, соответственно, составил 3 и 7 часов, среднее

время от заражения до гибели животных – 48,5 и 103 часа, количества

летальных исходов –100% и 50%, объём поражённой лёгочной ткани - 70% и

47,5%, что свидетельствует о разной вирулентности культуры одного штамма на

различных стадиях развития популяции.

Помимо свойств заражающей культуры возбудителя на течение и исход

болезни влияют факторы внешней среды. В эксперименте показано значение

факторов микроклимата. Двенадцать заражённых одной культурой свиней

содержали в условиях микроклимата, соответствующего зоогигиеническим

нормам, (группа А) и свиноводства отклонениями (группа Б). В группах А и Б

соответственно всего пало 66,6% и 100% свиней, из них в течении 24 часов –

33,3% и 66,6%. Среднее время от заражения до гибели в группах составило

67,5 и 27,3 часа. Объём поражённой лёгочной ткани - 32,2(12,1% и 59,5(5,9%.

Различия по последнему показателю в группах А и Б статистически достоверны

(р(0,01).

В опытах экспериментального воспроизведения актинобациллёзной

пневмонии на морских свинках, свиньях, а также при исследовании животных,

павших в условиях неблагополучного хозяйства, исследована диссеминация

возбудителя.

При летальном исходе у свиней наиболее часто культуры возбудителя

изолировали из поражённых участков лёгочной паренхимы (100%), бронхиальных

и средостенных лимфатических узлов (63,33 - 100%), реже – из печени,

селезёнки, почек, костного мозга, крови, головного мозга. Полученные данные

определяют характер материала, отбираемого для бактериологического

исследования.

Исследования экспериментально заражённых морских свинок

(интраназальная инокуляция) показало, что изменения в лёгких в виде

очаговой гиперемии в зоне ветвлений крупных и средних бронхов развиваются

уже через час после инокуляции культуры. Возбудитель на это стадии

реизолировали из лёгочной ткани, бронхов, трахеи. Через три часа в лёгких

развивались типичные изменения. На этой стадии в 25% случаев культуры

возбудителя реизолировали из крови и паренхиматозных органов. По истечении

6 часов изменения в лёгких получили полное развитие. Таким образом,

бактериемия и диссеминация возбудителя происходит на фоне уже имеющихся

изменений в лёгких.

Наблюдение за экспериментально заражёнными больными свиньями в

условиях неблагополучного хозяйства позволяют выделить три варианта течения

болезни: сверхострое, острое и подострое. При сверхостром течении на фоне

жёсткого респираторного синдрома летальный исход наступает в течении 6-24

часов. В грудной полости, где расположены поражённые доли лёгкого,

обнаруживали 150-300см3 красноватой жидкости, изменённая доля лёгкого

увеличена в объёме, ткань на разрезе тёмно-красного цвета, интерлобулярные

септы отёчны, консистенция поражённой ткани плотная, с разреза стекает

красноватая жидкость, бронхи и трахея заполнены аналогичной пенистой

жидкостью. Отложения фибрина на пульмональной и костальной плевре

отсутствуют.

У животных с острым течением болезни отмечен прогрессирующий

респираторный синдром с повышением температуры до 40,6—41(C, завершающийся

летальным исходом в течении 6—7 суток. У павших свиней в грудной полости

находили до 200 см3 красноватой жидкости с хлопьями фибрина. Поражённые

лёгкие тёмно-красные, плотные, ломкие, с выраженным отёком междольковой

соединительной ткани. Костальная и лёгочная плевра покрыты плёнками

фибрина.

У свиней с подострым течением регистрировали симптомы пневмонии,

лихорадку ремитирующего типа, плохую поедаемость корма. Поражённые доли

лёгких увеличены, бугристые, плотные, неравномерно окрашены: участки тёмно-

красного, серо-коричневого, грязно-бурого цвета. Через 15-20 дней в

лёгочной ткани обнаруживали очаги уплотнения, окружённые соединительной

тканью. Отложения фибрина на лёгочной и костальной плевре пронизаны

соединительной тканью.

Гистологические изменения в лёгких на начальной стадии болезни могут

быть охарактеризованы как бактериальный токсический шок (Гистологические

исследования проведены д.в.н. Шубиным В.А.) Типичным для органопатологии

бактериального шока считается парез и стаз артериол, мелких артерий,

набухание и фибриноидный некроз стенок. Присоединение внутрисосудистого

свёртывания крови придаёт шоку необратимый характер и приводит культур

возникновению некрозов ткани. Дальнейшие изменения развиваются на указанном

фоне. На 2-3 сутки начинается инфильтрация поражённых тканей

мононуклеарными клетками, в основном лимфоцитами, при отсутствии или малом

количестве нейтрофилов, эти клетки формируют своеобразный демаркационный

вал. Позднее в поражённых тканях развиваются некротические очаги,

подвергающиеся инкапсуляции. В зависимости от течения болезни и сроков

гибели животного обнаруживается та или иная стадия патологического

процесса.

Подтверждением вывода о ведущей роли токсинов в патогенезе

актинобациллёзной плевропневмонии являются следующие результаты наших

исследований. Установлено, сто в периодической аэрируемой культуре

возбудитель в первые три часа культивирования синтезирует термолабильные,

чувствительные к трипсину гемолизин и экзотоксин. Динамика их накопления и

инактивации в культуральной жидкости, содержащей гемолизин и экзотоксин,

вызывает у морских свинок в лёгких изменения типичные для актинобациллёзной

пневмонии. По нашему мнению, 6-8- часовые агаровые и 3- часовые бульонные

аэрируемые культуры в физиологическом отношении близки, поскольку находятся

в начальной стадии логарифмического роста. Поэтому мы считаем, что на

первом этапе развития изменений в лёгких определяющую роль играют гемолизин

и экзотоксин. По нашему мнению, 6-8- часовые агаровые культуры возбудителя

содержат не некоторое количество в связанном виде гемолизина и экзотоксина,

что определяет большую вирулентность молодых культур.

4. Патогенные свойства H.parasuis.

Исследовали чувствительность в возбудителю морских свинок, белых

мышей, поросят-отъёмышей.

ЛД50 культуры H.parasuis штамм №1 для морских свинок при

интраназальном заражении составила 354 млн.м.к., внутрибрюшинном - 594

млн.м.к., подкожном - 1,414 млд.м.к.. При всех способах заражения с

различной частотой обнаруживали развитие серозно-фибринозного плеврита,

перитонита, реже перикардита. После интраназальной инокуляции у 100%

животных отмечали развитие катаральной пневмонии. У павших животных

культуры возбудителя наиболее часто выделяли из поражённых серозных

оболочек и реже - из паренхиматозных органов.

ЛД50 культуры H.parasuis при внутрибрюшинном введении штамма серовара

С составила [pic], [pic], [pic], [pic]. Белые мыши, как и морские свинки

были более чувствительны к внутрибрюшинному (ЛД50=1,414 млрд.м.к.) и

интраназальному (ЛД50=1,549 млрд.м.к.) способам заражения при устойчивости

к подкожному введению культуры. Патологоанатомические изменения у мышей и

морских свинок были однотипны.

С нашей точки зрения, морских свинок можно рассматривать как наиболее

удобную модель для биопробы и изучения пато - и иммуногенеза инфекции,

вызываемой H.parasuis.

В опытах на поросятах-отъёмышах показано, что гемофилёзный

полисерозит может быть воспроизведён при интраназальном, трахеальном,

внутрибрюшинным и внутривенном введении культуры H.parasuis. Учитывая

экологию возбудителя, можно констатировать, что естественными входными

воротами инфекции являются дыхательные пути. При трахеальном заражении

первые клинические симптомы в виде угнетения и повышения температуры тела

отмечаются через 6-8 часов, позднее (20-24 часа) у абсолютного большинства

животных развивается катаральная пневмония. В 75% случаев уже на этой

стадии развивается серозно-фибринозный плеврит и в 50% случаев - перитонит,

что свидетельствует о высоких инвазивных свойствах возбудителя. У животных,

убитых через 24 часа после заражения, на фоне описанных

патологоанатомических изменений культуры возбудителя были выделены в 100%

случаев из лёгких и бронхиальных лимфатических узлов и в 25% случаев - из

крови. В более поздние сроки существенных изменений в характере

патологоанатомических изменений не наступало, за исключением резорбции

экссудата из полостей и появления у отдельных животных симптомов поражения

суставов конечностей и головного мозга. Гистологические исследования

(выполнены д.в.н., профессором Шубиным В.А.) позволяют охарактеризовать

изменения у экспериментально заражённых и естественно больных свиней как

септико-токсический процесс с поражением серозных покровов, паренхиматозных

органов, лимфатических узлов и центральной нервной системы.

Исследования показали, что типичные патоморфологические изменения

могут вызвать как капсулообразующие, так и бескапсульные формы возбудителя

при большей вирулентности первых.

По нашим данным изменения в лёгких, плевре, перикарде и перитонеуме

ассоциируются с локализацией в них возбудителя. Частота изоляции культур

H.parasuis из тканей и органов зависит от характера болезни и давности

процесса. При остром течении в результате экспериментального (трахеального)

заражения через 48-72 часа из лёгких культуры возбудителя выделили в 100%

случаев, плевры - 75%, перитонеума и перикарда -25%, бронхиальных

лимфатических узлов - 100%, селезёнки - 50%, крови - 25% случаев. При

бактериологическом исследовании поросят, павших с картиной острого

полисерозита, в естественных условиях культуры возбудителя выделили из

лёгких у 42,85%, перикарда - 92,2%, плевры - 71,42%, печени - 57,14%,

селезёнки - 66,66% животных. В более отдалённые сроки после

экспериментального заражения и от животных, павших в естественных условиях

с картиной подострого полисерозита, возбудитель выделяли реже и

преимущественно из плевры, лёгких, перикарда, перитонеума и средостенных

лимфоузлов.

Анализ возрастной заболеваемости поросят гемофилёзным полисерозитом

показал, что пик отхода приходится на возраст 35-60 дней. Появление отхода

поросят с явлениями гемофилёзного полисерозита совпадает со снижением титра

колостральных антител к H.parasuis (серовар Д), увеличением уровня

колонизации возбудителя в респираторном тракте. Согласно полученным данным,

H.parasuis является достаточно обычным компонентом нормальной микрофлоры

слизистых путей и на фоне описанных изменений, наряду с другими

Страницы: 1, 2, 3