Современная генетика

succesiunea compus? din ?ase nucleotide GTC, GAC, pe care o taie exact la

mijloc.

Restrictaza cu denumirea conven?ional? RI «recunoa?te» o alt? succesiune

a nucleotidelor GAA TTC ?i «taie» ADN-ul оn acest loc asimetric, «оn

trepte». La fel de asimetric, dar оn alt? direc?ie ADN-ul este t?iat de

restrictaza PstI ?. a. m. d. Toate aceste fragmente t?iate pot fi suturate

din nou оntr-un tot оntreg de fermentul ligaza. Оn prezent cunoa?tem peste

patru sute de restrictaze ?i lista lor se completeaz? mereu. Cu ajutorul

fermen?ilor polii fragmentelor ADN pot fi lungi?i, din ei pot fi

оndep?rtate sectoare aparte, ADN-ul poate fi t?iat exact оn locul necesar,

adic? genele pot fi separate, croite ?i recroite dup? voia

experimentatorului, ceea ce este foarte important pentru construirea

moleculelor de ADN hibride sau recombinante.

Deoarece savan?ii dispun de un num?r limitat de gene pentru ob?inerea

moleculelor recombinante, ei utilizeaz? оn calitate de surse de gene, оn

primul rоnd, ADN-ul total, fragmentat sau t?iat оn segmente aparte de

fermen?ii restric?iei. Aceast? metod? a fost numit? metoda fragment?rii.

Datorit? ac?iunii restrictazelor ADN-ul se scindeaz? оn numeroase

fragmente, unele dintre ele con?inвnd gene.

Popula?ia acestor molecule de ADN este multiplicat? оn sistemul

bacterial, dup? care se selecteaz? genele necesare. La selectare este

folosit de obicei ca prob?-test ARNi radioactiv, sau copia ADNc, care

corespunde acestei gene. Aceast? metod? permite separarea atвt a genelor

ce se repet?, cвt ?i a genelor unice. Dificult??ile legate de selectarea

genelor unice se datoresc concentr?rii lor mici оn ADN-ul total. Astfel,

bun?oar?, printre fragmentele de ADN total un fragment de gen? unic? revine

la un milion de toate celelalte fragmente.

Оn prezent din ADN-ul total al unei serii de obiecte au fost separate

genele structurale. S. Cohen ?i D. Hogness оmpreun? cu colaboratorii lor au

separat pentru prima oar? din ADN-ul ariciului-de-mare ?i drosofilii cloni,

care con?in gene histonice ?i ribozomice.

La Institutul de biologie molecular? al A? al fosteо URSS (laboratorul

lui G. Gheorghiev) оn colaborare cu Institutul de energie atomic? I. V.

Curceatov (V. Gvozdev ?i colaboratorii s?i) s-a ob?inut prin intermediul

acestei metode o serie de gene structurale din ADN-ul drosofilei. Deoarece

acest obiect a fost bine studiat din punct de vedere genetic, prezint?

interes determinarea direct? a localiz?rii ?i func?iei posibile оn cromozom

a genelor separate.

Savan?ii au оnv??at nu numai s? separe din ADN gene ale diferitelor

organisme, dar ?i s? sintetizeze gene artificiale. Prima gen? artificial?,

care a оnceput s? func?ioneze, a fost sintetizat? de un grup de

colaboratori ai Institutului tehnologic din Massaciusets (SUA) оn frunte cu

X. Khorana - laureat al Premiului Nobel. Acasta a fost gena ARNt al

tirozinei.

Оn anul 1970 la Simpoziumul interna?ional de chimie ai compu?ilor

naturali din ora?ul Riga X. Khorana a f?cut o comunicare cu privire la

sintetizarea p?r?ii structurale a unei alte gene - ARNt al alaninei.

Acestei gene оi lipseau, оns?, оnc? cвteva p?r?i componente, ?i de aceea n-

a putut func?iona оn celule str?ine. Tot atunci colaboratorii laboratorului

lui X. Khorana au reu?it s? sintetizeze un segment din 85 de perechi de

nucleotide, care corespundea succesiunii ini?iale a ARNt-ului tirozinei.

Dar ?i aceast? gen? ca ?i cea a ARNt-ului alaninei s-a dovedit biologic

inactiv?.

Mai curвnd s-a clarificat una din cauzele e?ecului - оn celul? se

sintetizeaz? la оnceput ARNt-ul precursor compus din 126 de nucleotide.

Dup? aceasta un ferment special taie o parte din molecula precursoare ?i

abia atunci se transform? оn molecul? lucr?toare. A fost determinat?

succesiunea acestei precursoare ?i sintetizat segmentul respectiv de ADN

compus din 126 perechi de nucleotide. Dar nici Aceast? gen? nu era activ?

din punct de vedere biologic.

?i aici a devenit limpede c? gena artificial? nu va putea func?iona оn

celul?, dac? nu va fi оnzestrat? cu sectoare de reglare - cu promotorul

care pune оn func?iune sinteza ARNt-ului ?i terminatorul care pune cap?t

sintezei. A fost nevoie de metode speciale pentru a determina succesiunea

acestor sectoare de reglare. S-a constatat c? promotorul con?ine 59 perechi

de nucleotide, iar terminatorul - 21 de perechi. A fost sintetizat? o gen?

complicat? cu promotor ?i terminator. Ba chiar mai mult, pentru ca celula

s? nu recunoasc? оn gen? un str?in, s-a decis c? ea s? nu se plimbe la

voie, c? ea trebuie suturat? оn ADN-ul celulei. Оn acest scop la ambele

poluri ale genei sintetizate au fost unite capete «lipicoase» cu un singur

filament. Tocmai aceste poluri se formeaz? оn ADN, cвnd fermentul

restrictaza оl taie оn buc??i.

Dac? se va ac?iona asupra ADN-ului cu restrictaza, iar apoi se va ad?uga

gena sintetic?, capetele ADN-ului ?i ale genei se vor lipi unul de altul ?i

gena se va оncorpora оn ADN. R?mвne doar de suturat jonc?iunile cu

fermentul ligaza. Savan?ii au procedat tocmai a?a. ?i... iar au e?uat.

Bacteria E. coli n-a receptat gena str?in?. Cercet?torii erau aproape

dispera?i. ?i atunci au оncercat s? sutureze gena nu оn ADN-ul

colibacilului, ci оn ADN-ul unuia din virusurile, care se оnmul?esc оn

aceast? bacterie. De data aceasta savan?ii au lucrat bucurвndu-se de

succes: dup? ce celula colibacilului a fost infectat? cu virusul, оn gena

c?ruia a fost оncorporat? gena artificial?, bacteria a оnceput a sintetiza

ARNt-ul codificat оn aceast? gen?.

A?a dar, a оnceput a func?iona prima gen? sintetic?.

De atunci familia genelor sintetice artificiale cre?te mereu. Оndat? ce a

fost descoperit fenomenul reverstran-scrip?iei, adic? procesul de

transferare a informa?iei genetice de la ARN la ADN, savan?ii au оnceput s?

vorbeasc? despre posibilitatea unei noi c?i, fermentative, de sinteza

genei.

Pentru aceast? sintez? serve?te ca matri?? ARN-ul, care se elaboreaz? оn

celul? ?i prezint?, precum ?tim, o copie complementar? a unui fragment

anumit al ADN-ului. Dup? ce am separat acest ARNi, putem ob?ine prin

transcriere invers? o molecul? de ADN complementar? ei. Probabil c? ea va

fi o copie fidel? a genei ini?iale.

Primele experien?e reu?ite de sintetizare fermentativ? a genei au fost

efectuate оn laboratoarele din str?in?tate оn anul 1972.

Оn anul 1973 L. Chiseliov ?i L. Frolova, colaboratori la Institutul de

biologie molecular?, precum ?i C. Gazarean ?i V. Tarantul de la Institutul

de energie atomic? «Curceatov», dirija?i de academicianul V. A. Enghelgard,

au ob?inut partea informatic? a genei, globina, utilizвnd matri?a ARNi-ului

globinic din celulele porumbelului.

Оn acest timp оn cadrul proectului «revertaza» a activat ?i un alt grup

de savan?i - V. Cavzan ?i A. Rвndici de la Institutul de biologie

molecular? ?i genetic? al A? Ucrainene, care au reu?it ?i ei s? sintetizeze

gena globin?, utilizвnd drept matri?? ARNi-ul globinic al iepurelui de

cas?, nu al porumbelului.

Оn anul 1979 s-au soldat cu succes lucr?rile de sintetizare a genelor de

bradichinin?, datorit? eforturilor comune ale savan?ilor de la Institutele

de genetic? general? ?i de chimie bioorganic? ?i de anghiotenzin? - de

c?tre savan?ii Institutului de citologie ?i genetic? al A? a Federa?iei

Ruse.

Оn anul 1981 la Institutul de biologie molecular? un grup de colaboratori

(S. Deev, N. Barbacari, O. Poleanovschii ?. a.) au sintetizat ?i au

transferat оntr-o celul? bacterian? o gen? care codifica una din catenele

u?oare ale imunoglobulinei. Mai tвrziu оn ?ara noastr?, cвt ?i оn

laboratoarele str?ine au fost sintetizate multe gene: a somatostatinei,

somatotropinei, insulinei, interferonului ?. a. care ?i-au g?sit aplicare

larg? оn practic?.

10.4 Clonarea genelor

Genele separate din alte organisme sau sintetizate artificial pe cale

chimic?. fiind transferate оn celule noi, nu sunt оn stare s? se reproduc?

nici s? se transmit? descenden?ei acestor celule. Acest lucru se poate

ob?ine, dac? ele se vor introduce оn prealabil оn componen?a structurii

genetice, care are un aparat propriu de reproducere. Оn ingineria genetic?

aceast? structur? este cu adev?rat figura central? оn toate manipul?rile

ingineriei genice. poart? numele de vector, sau «transportor».

Vectorul este o molecul? de ADN capabil? s? transfere оn celul? o gen?

str?in? ?i s? asigure acolo оnmul?irea ei, sintetizarea produsului proteic

?i оncorporarea оn cromozom.

De cele mai multe ori оn calitate de vector sunt utilizate plazmidele

bacteriilor, virusurile bacteriilor (bacteriofagii) ?i virusurile

animalelor, precum ?i cosmidele, care con?in elemente genetice ale

plazmidelor ?i ale bacteriofagilor.

Molecula-vector trebuie s? aib? capacitatea de replicare autonom? ?i s?

con?in? anumite gene de semnalare (marcatori), bun?oar? gene de rezisten??

la antibiotice, care permit descoperirea ?i identificarea celulelor

modificate.

Plazmidele sunt larg r?spвndite оn lumea bacteriilor. Sunt, precum s-a

notat mai sus, mici molecule inelare de ADN, care se afl? оn celulele

bacteriale. Poate fi o molecul? sau cвteva. Plazmida con?ine genele

necesare pentru reproducerea ADN-ului ?i genele rezistente la antibiotice,

de exemplu la ampicilin? ?i tetraciclin?, precum vedem оn fig. 22.

Оn interiorul acestor gene se afl? fragmente pe care le recunosc

restrictazele. Asemenea fragmente exist? bineоn?eles ?i оn alte locuri ale

plazmidei, dar cele din interiorul genelor de rezisten?? sunt deosebit de

importante, deoarece anume acolo se insereaz? ADN-ul str?in. Gena este

v?t?mat? ?i bacteria care con?ine o astfel de molecul? hibrid? devine

incapabil? s? opun? rezisten?? ac?iunii antibioticicor. Aceast?

particularitate permite selectarea pentru оnmul?irea continu? numai a

bacteriilor care con?in molecula hibrid? sau molecula recombinant? de ADN.

A?a dar, moleculele recombinate con?in gene care trebuie оnmul?ite ?i

vectorii cu ajutorul c?rora se realizeaz? acest proces.

To?i vectorii plazmidici utiliza?i оn ingineria genetic? sunt crea?i pe

cale artificial? prin reunirea unor p?r?i aparte a diferitelor plazmide

naturale.

Unele plazmide au o particularitate foarte important?: dac? asupra

celulelor оn care exist? acest vector se va ac?iona cu antibioticul

cloramfenicol, оn ele num?rul copiilor de plazmid? va spori pвn? la 1-3

mii. Astfel se m?re?te doza genei necesare. ceea ce permite a se ob?ine

gena оncorporat? оn plazmid? (sau produsul acestei gene) оn mari cantit??i.

Dar cum se ob?ine o molecul? recombinat?? Cum se realizeaz? clonarea

(inserarea) genei str?ine оn plazmid?? Principalele opera?ii ale acestui

proces sunt indicate оn fig. 23.

Оn acest scop trebuie s? avem un ADN al plazmidei - vector (de exemplu P1

?i ADN-ul organismului care ne intereseaz?. ADN-ul plazmidic ?i cel str?in

este tratat cu restrictaz? (bun?oar? Bam1), dup? care la plazmid? оn gena

de rezisten?? fa?? de tetraciclin? se formeaz? o ruptur? ?i moleculele

inelare se transform? оn liniare. Apoi ambele preparate scindate ale ADN-

lui se amestec? unul cu altul ?i sunt tratate cu ligaz?. Fragmentele de ADN

se unesc ?i formeaz? plazmida recombinant? sau un ADN hibrid.

Dup? aceasta urmeaz? procedura de selectare a acestor molecule hibride:

tot amestecul de molecule prelucrate cu ligaz? se introduce оn celulele

bacteriale. Apoi aceste celule sunt a?ezate оntr-un mediu nutritiv solid cu

antibioticele ampicilin? ?i tetraciclin?. Celulele care con?in plazmida

hibrid? vor cre?te оn mediul cu ampicilin?, dar nu vor cre?te оmpreun? cu

ambele antibiotice, deoarece gena rezisten?ei din plazmida tetraciclinei a

fost defectat? de inser?ie.

Cre?terea selectiv? permite colectarea celulelor ce con?in molecula

hibrid? ADN. Оn continuare ele se оnmul?esc ?i ADN-ul recombinant, ob?inut

din ele оn cantit??i mari, este utilizat оn diferite scopuri.

A?a dar, din momentul introducerii ADN-ului recombinant оn celul? оncepe

clonarea molecular?, adic? ob?inerea urma?ilor moleculei recombinate,

create оn mod artificial. Оn acest scop pentru celulele transformate sunt

create condi?ii specifice оn vederea select?rii lor, ?inвndu-se seama de

marcatorii geneticii, care semnaleaz? prezen?a celulelor pentru selec?ie.

Drept urmare se ob?ine o tulpin? absolut omogen?, din care, оn dependen??

de scop, se separ? ori gena clonat?, ori produsul ei.

Acestea sunt оn linii generale bazele teoretice ale ingineriei genetice.

Ingineria genetic? face abia primii pa?i, dar de acum ast?zi putem vorbi

despre perspectivele aplic?rii realiz?rilor ei оntr-o serie de domenii din

sfera material?. Оn etapa actual? cea mai larg? aplicare o are ingineria

genetic? a microorganismelor.

XI. INGINERIA GENETIC? LA MICROORGANISMELE INDUSTRIALE

11.1 Activitatea enigmatic? a microorganismelor vii

La majoritatea oamenilor no?iunea de «microb» sau «bacterie» se asociaz?

оnainte de toate cu gravele boli infec?ioase, provocate de ei. Pu?ini оns?

cunosc activitatea cu adev?rat fantastic? a acestora, participarea extrem

de activ? a bacteriilor la procesul de formare a scoar?ei p?mвntului, la

formarea sedimentar?, z?c?mintelor de petrol, c?rbune, metale ?i a

celorlalte minerale utile

Pe uscat activitatea biologic? a bacteriilor a pus temeliile regnului

vegetal, inclusiv bazele agriculturii - solul roditor. Savan?ii consider?

c? solul este un laborator microbiologic al naturii.

Plantele agricole absorb din sol anual peste 110 mln tone de azot. Odat?

cu sporirea recoltei cre?te ?i consumul de azot de c?tre plante. Oamenii оi

restituie solului оn form? de оngr???minte minerale numai jum?tate din

azotul absorbit de plante, de aceea, dac? n-ar exista microorganizmele care

asimileaz? azotul din aer, lanurile ar fi de mult sec?tuite

Un mare aport оn fondul «azotului biologic» оl aduc оn primul rвnd

bacteriile care tr?iesc оn nodozitd?ile de pe r?d?cinile plantelor

leguminoase. Tocmai ele fixeaz? azotul liber ?i оl transmit plantelor. Cele

mai bune culturi de bacterii radicicole sunt utilizate la prepararea

nitraginei - оngr???mвnt bacterial care este introdus оn sol оmpreun? cu

semin?ele leguminoaselor pentru a intensifica fixarea azotului din

atmosfer?.

La fabricile industriei microbiologice bacteriile ?i drojdiile se

utilizeaz? cu succes la fabricarea unui produs nutritiv de valoare - a

concentratului de protein?-vitamin?. Savan?ii se st?ruie cu insisten?? s?

creasc? prin metodele ingineriei genetice ni?te microbi оn stare s?

«m?nвnce» petrolul ?i consider? aceste organisme drept prieteni, nu

du?mani, deoarece ele vor ajuta la purificarea suprafe?ei m?rilor ?i

oceanelor de petrolul care ar nimeri оn ele оn cazurile de avariere a

petrolierelor. Academicianul A. A. Im?ene?chii consider?, pe bun? dreptate,

c? оmp?r?irea microbilor оn microbi d?un?tori ?i microbi utili, оn microbi

buni ?i microbi r?i este foarte conven?ional? ?i nu totdeauna just?. F?r?

activitatea gigantic? a acestor sanitari, inaccesibili ochiului nostru, apa

?i p?mвntul demult ar fi acoperi?i cu resturi de plante ?i cadavre ale

animalelor ?i pe?tilor.

Оn lumea microbilor au fost descoperite fenomene noi, cu totul

nea?teptate, cu adev?rat «minunate» S-a constatat, bun?oar?, c? bacteriile

elimin? оn mediu ambiant ?i asimileaz? din el unele gene ?i chiar blocuri

оntregi de gene sub form? de fragmente de ADN. A?a se realizeaz? metoda de

schimb de informa?ie ereditar? оntre microorganismele necunoscute оnainte

?i оntre cele ce apar?in speciilor оndep?rtate.

Majoritatea covвr?itoare a microorganismelor descoperite pвn? оn prezent

ne sunt prietine, оn anumite condi?ii ele pot fi utilizate cu eficacitate

оn interesele omului. Important este s? fie utilizate «la maximum» formele

de microorganisme produc?toare de protein? ?i de substan?e cu activitate

biologic? atвt de necesare pentru medicin?, agricultur?, diferite ramuri

ale industriei, precum ?i de microorganisme capabile s? extrag? metale

neferoase, nobile ?i rare, s? distrug? resturile de pesticide, de?eurile

materialelor sintetice care polueaz? mediul ambiant.

Оn anii r?zboiului al doilea mondial frontul ?i spatele frontului aveau

nevoie de substan?e medicamentoase antimicrobiene de mare eficien??.

Medicii ?tiau c? оnc? оn anul 1929 microbiologul englez A. Fleming a

descoperit c? ciuperca de mucegai, penicilium, secret? ni?te substan?e

nimicitoare pentru bacterii ?i care nu sunt d?un?toare pentru celulele

omului ?i animalelor. Оn anul 1941 savan?ii de la Universitatea din Oxford

(SUA) au creat pe baza acestor date primul preparat antibiotic penicilina,

despre оnsu?irile lui t?m?duitoare circulau legende.

Microbiologii din fosta URSS n-au avut la dispozi?ie o tulpin? (o

cultur?) asem?n?toare de ciuperc? de mucegai care s? produc? penicilina. S-

au оnceput c?ut?ri оndelungate ?i dificile pentru a g?si un produc?tor

propriu 3. Ermoleva ?i T. Balezina, colaboratoare la Institutul unional de

medicin? experimental?, controlau pe rвnd activitatea biologic? a

diferitelor probe de ciuperc? de mucegai ?i numai una dintr-o sut? de probe

- penicilium crustozum s-a dovedit a fi potrivit?. Ea a devenit

«produc?torul» preparatului de penicilin?.

Оn anul 1944 dintr-o alt? cuperc?-actinomicet? a fost separat?

streptomicina. Acest antibiotic a devenit pentru mult timp substan?a

medicamentoas? fundamental? contra multor boli: tuberculoz?, pest?,

tularemie, bruceloz? ?. a. Оn multe ??ri au fost organizate lucr?rile оn

vederea c?ut?rii de noi specii de actinomicete, produc?toare de

antibiotice. Dac? pвn? la descrierea streptomicinei microbiologii cuno?teau

35 de specii de actinomicete, оn prezent se cunosc sute de acestea.

Astfel pe parcursul studierii resurselor inepuizabile ale

microorganismelor s?lbatice (naturale), microbiologii asemeni geologilor,

care efectueaz? lucr?rile de explorare a minereurilor utile, caut? ?i

g?sesc mereu noi specii ?i tulpini de bacterii, ciuperci, virusuri cu

caractere ?i оnsu?iri utile, descoper? capacit??ile ?i «talentele» lor.

Dintre aceste ciuperci fac parte ?i ni?te organisme monocelulare enigmatice

- drojdiile.

La multe fabrici de drojdii furajere sunt instalate aparate ce produc 28-

30 tone de mas? biologic? uscat? pe zi. O ton? de drojdii con?ine

aproximativ 500 kg de protein? digerabil?. Prin urmare, оn fiecare dintre

aceste aparate (fermentiere) se formeaz? оntr-o zi aproape 15 tone, iar

оntr-un an 4-5 mii tone de protein? digerabil? de оnalt? calitate. Este

mulg sau pu?in?

Un fermentier este egal ca productivitate cu aproximativ 4-5 complexe de

cre?tere a porcilor a cвte 100 mii de porci fiecare. Aceste cifre

demonstreaz? conving?tor ce prezint? sinteza microbian?, cвt de mare este

intensitatea ?i productivitatea ei.

E de la sine оn?eles c? drojdiile nu au calit??ile c?rnii de vit? sau ale

celei de porc. Din ele nu se pot prepara biftecuri. Dar nutre?urile оn care

se adaug? drojdii ?i alte substan?e microbiologice - vitamine, fermen?i,

aminoacizi - fac minuni. Animalele tinere devin mai s?n?toase, mai

puternice, cresc ?i se dezvolt? mai repede, spore?te prolificitatea

femelelor, se ridic? sporul оn greutate, iar termenele de оngr??are se

reduc. Proteina ce se con?ine оn drojdii este doar mai bine echilibrat? din

punct de vedere al componen?ei aminoacizilor (lizin?, metionin?, triptofan,

treanin?) indispensabili, decвt proteinele cerealierelor. Drojdiile de

nutre?, fiind un concentrat natural de protein?, vitamine ?i alte substan?e

biologice active, оntrec dup? valoarea lor biologic? cu mult boabele de

graminee. Se ?tie, c? dac? la un kilogram de gr?un?e de grвu se adaug?

numai patru grame de lizin?, 1,5 grame de treanin?, proteina acestei pвini,

conform valorii biologice, aproape nu se va deosebi de cazein? - proteina

principal? a laptelui.

Se mai ?tie c? animalele pot utiliza cu eficacitate numai o parte de

protein? din nutre? care este propor?ional? cu partea cea mai deficitar? a

aminoacidului indispensabil. De aceea dac? cel mai valoros component al

boabelor furajere - proteina - nu este echilibrat? dup? lizin?, organismul

animalelor o cheltuie?te nu pentru formarea de carne, lapte, ou? ?. a., ci

оn calitate de combustibil - pentru necesit??ile energetice, lucru ce nu

este deloc convenabil. Acela?i lucru se оntвmpl? dac? cerealele furajere

con?in o cantitate insuficient? de al?i aminoacizi - triptofan ?i treonin?.

Drojdiile оntrec mult dup? calit??ile lor nutritive toate celelalte

plante superioare. De aceea ele au g?sit o utilizare larg? оn calitate de

adaos furajer. Ele «se hr?nesc» cu pl?cere cu hidrocarburi de petrol,

purificвnd mediul ambiant de ace?ti poluan?i. Lista «bunelor servicii» ale

lumii fiin?elor invizibile poate fi continuat? la infinit. Industria de

producere a acestor celule vii are ca scop tocmai transformarea microbilor

оn produc?tori cu profil larg, mai ales ?inвndu-se cont de viteza cu care

ele fabric? produsele. Vom aduce aici urm?toarea compara?ie a lui B.

Neiman: dac? s-ar ini?ia o competi?ie - cine va putea da mai mult?

produc?ie, de exemplu de cea mai valoroas? protein?, comunitatea celulelor

microbiene mici la infinit ?i-ar dovedi cu siguran?? superioritatea fa?? de

un taur.

Aducem calculul lui B. Neiman: taurul cu o greutate vie de 300 kg dup? o

zi de оngr??are intens? spore?te оn greutate cu 1,1-1,2 kg, inclusiv cu 20

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30