Современная генетика

privire la оntreruperea sarcinii, pentru a nu avea copil cu anomalii.

Sexul viitorului copil a fost prima diagnosticare intrauterin?. Aceasta

a avut loc оn anul 1955, iar оn anul 1960 aceast? realizare a adus primul

folos practic: la o mam? purt?toare a bolii ereditare, care ap?rea pe linia

b?rb?teasc?, a fost diagnosticat sexul f?tului. Оn anul 1961 cu ajutorul

amniocentezei a fost determinat? incompatibilitatea dintre f?t ?i mam? dup?

factorul rezus, iar оn anul 1968 a fost eviden?iat? intrauterin boala Down.

Un alt exemplu elocvent al folosirii metodelor ingineriei genice оn

diagnosticarea prenatal? a bolii ereditare, ce ?ine de sex, este

eviden?ierea precoce a distrofiei musculare Diu?en. Aceast? boal? se

manifest? оn fraged? copil?rie prin sl?birea progresiv? a mu?chilor ?i, оn

cele din urm?, copilul r?mвne ?intuit la pat. Boala conduce la o moarte

precoce a bolnavului. Gena defectat? de care ?ine boala, ca ?i оn cazul

hemofiliei, este localizat? оn cromozomul X ?i este recisiv?, de aceea

boala afecteaz? numai reprezentan?ii sexului tare. B?rba?ii au doar un

singur cromozom X ?i de aceea valoarea incomplet? a genei se manifest?

neap?rat. La feti?ele care au doi cromozomi X, din care unul func?ioneaz?

normal, ac?iunea genei defectate este compensat? de gena de valoare

complecta.

Femeia poate fi s?n?toas?, purtвnd concomitent catastrofa оn unul din

cromozomii ei X. Cвnd un b?rbat s?n?tos se c?s?tore?te cu o femeie

purt?toare a genei defectate, e posibil? na?terea copiilor s?n?to?i, dar ?i

bolnavi, care au mo?tenit de la mam? un cromozom X defectat. Analiza

repartiz?rii fragmentelor restric?ionale dintr-un anumit segment de

cromozomi X permite s? se eviden?ieze gena defectat? la mam? ?i la copii.

Dac? aceast? gen? a fost descoperit? оn ADN-ul fiului, оnseamn? c? el a

fost afectat de boal?. Aceasta se poate stabili prenatal ?i atunci

p?rin?ii vor putea hot?rо оn prealabil dac? doresc sau nu s? aib? un copil

bolnav incurabil.

Analiza restric?ional?, ca metod? a ingineriei genice, care are drept

scop diagnosticarea bolilor ereditare, este foarte simpl?. Pentru ea este

suficient ADN-ul dintr-o singur? celul?.

S? presupunem c? este vorba de drepanocitoz?, o boal? de care sufer? zeci

de milioane de oameni din lumea оntreag?. Pentru a se verifica dac? acest

defect ?ine de gena globinei de sвnge sau de alt? cauz?, ADN-ul ob?inut din

cromozomii bolnavilor este prelucrat cu restrictaza Xpa 1. Dac? dup?

prelucrare se ob?ine un fragment de ADN cu o lungime de 13 mii perechi de

baze, оnseamn? c? exist? o gen? defectat?, care poate conduce la

оmboln?vire. M?rimea normal? a genei globinei de sвnge la om este de 7600

de baze. Siguran?a acestui diagnostic este de 80%. Metoda diagnostic?rii

dup? fragmentele restricte de ADN caracteristice anumitor gene se folose?te

tot mai larg оn practica medical? ?i continu? s? fie perfec?ionat?. Pentru

terapia genic? prezint? o mare importan?? munca de perfec?ionare a

coordonatelor exacte a genelor din cromozomi. Pвn? оn prezent s-a stabilit

localizarea pe cromozomii omului a mai mult de 800 de diferite gene. Au

ob?inut «оnscrierea» pe cromozomi ?i 18 oncogene – gene capabile s?

provoace cancerul.

Pentru ca terapia genic? s? devin? posibil?, trebuie s? se respecte o

serie de condi?ii. Genele normale trebuie s? fie separate оn cantit??i

suficiente ?i bine studiate. Vectorii s? conduc? genele exact оn acele

organe ?i ?esuturi оn care ele func?ioneaz? de obicei. Mai e nevoie ?i de

elaborarea unei metode sigure de inserare a genei оn cromozomii omului.

Terapia bolilor genetice presupune, din punct de vedere al ingineriei

genice, introducerea оn aparatul genetic al omului оn care se afl? gena

(sau genele) defectat? a unei gene cu o informa?ie genetic? normal?. Оn

condi?ii ideale aceast? opera?ie poate fi realizat?, luвndu-se un ovul

fecundat, care urmeaz? s? fie transplantat mamei adoptive, pentru ca

informa?ia genetic? introdus? s? fie mo?tenit? de toate celulele

organismului ce se dezvolt? din el ?i s? se transmit? genera?iilor

ulterioare. Dar aici apar probleme, оncвt devine limpede c? a vorbi despre

utilizarea acestei metode оn medicin? este оnc? prea devreme.

Terapia celulelor somatice, care provoac? оn prezent un interes atвt de

mare, const? оn inserarea unei noi informa?ii genetice оn celulele somatice

care au un defect ereditar. Informa?ia inserat? corecteaz? defectele numai

la nivelul dat ?i nu se transmite prin ereditare. Оn aceast? direc?ie s-au

ob?inut de acum succese despre care vom vorbi mai am?nun?it.

Galactozemia este o boal? grea – omul bolnav nu poate asimila galactoza

(o parte component? a lactozei), deoarece оi lipse?te fermentul

galactotransferaza necesar pentru asimilarea ei. Acest ferment оi lipse?te

pentru c? оn cromozomul omului este defectat? gena responsabil? de sinteza

lui. Defectul cromozomic, prin urmare ?i boala оns??i, se transmite prin

ereditate. Galactozemia se combate, eliminвnd din hran? galactoza, dar

acest tratament nu poate fi considerat radical.

Fermentul despre care este vorba se оntвlne?te ?i la alte organisme, оn

special la colibacil.

La оnceputul deceniului al nou?lea colaboratorii Institutului de ocrotire

a s?n?t??ii (SUA) оn frunte cu C. Merril au оnceput s? studieze culturi ale

?esuturilor unor bolnavi de galactozemie. Ei au lucrat cu celulele

?esutului conjunctiv – cu fibrobla?tii, care cresc bine оn condi?ii de

laborator. Savan?ii au transferat оn celula fibroblastului prin transduc?ie

cu ajutorul bacteriofagului lambda o gen? a colibacilului, responsabil? de

produc?ia galactotraneferazei. Celula colibacilului, care con?ine fermentul

necesar, a fost contaminat? cu virus Bacteriofagul lambda a p?truns оn

celul?, s-a оnmul?it, iar noile lui genera?ii purtau de acum оn ADN-ul lor

material ereditar al colibacilului, оn special, gena responsabil? de

producerea galactotransferazei. Apoi aceste virusuri au fost introduse оn

cultura celulelor de fibrobla?ti ai omului. Оn urma acestor opera?ii

fibrobla?tii ob?ineau noi оnsu?iri, ei оncepeau s? asimileze galactoza.

Оnseamn? c? оn ADN-ul celulei omului a fost inserat? gena adus? de la

bacterii. Genera?iile urm?toare ale celulei lecuite s-au dovedit a fi ?i

ele s?n?toase. Astfel a avut loc vindecarea unei rele boli ereditare.

Este interesant de men?ionat c? оn varianta de control, оn care virusul a

transmis materialul ereditar din celula mutant? a bacteriei, оn care gena

necesar? lipsea, fibrobla?tii nu c?p?tau nici o оnsu?ire nou?.

Astfel, a fost demonstrat? pentru prima dat? posibilitatea terapiei

genetice a celulelor somatice Dar aceste opera?ii fine au fost efectuate оn

celule crescute оn cultur?, оn afara organismului uman. Iat?, оns?, unele

rezultate mai noi ?i mai оncurajatoare Оn anii 1984–1985 un grup de savan?i

americani оn frunte cu R. Mallighen s-au ocupat de ADA (deficitul de

adenozin-dezaminaz?), o boal? ereditar? rar?. Aceast? boal? cauzeaz?

defec?iuni grave ADA inhibeaz? atвt de mult sistemul imun al omului, оncвt

o r?cire obi?nuit? poate deveni pentru el mortal?. Terapia genic? a purces

anume la cercetarea acestei boli, deoarece ea este cauzat? de deficitul de

ferment оn m?duva oaselor, ?esut, care asigur? cele mai bune condi?ii

pentru inserarea genelor s?n?toase оn organism. Оn m?duva oaselor se

formeaz? limfoci?ii – elementul de baz? al sistemului imun al organismului.

Deficitul de ferment provoac? elaborarea toxinelor, care оmpiedic?

dezvoltarea normal? a limfoci?ilor T.

Mallighen a elaborat o metod? inofensiv? ?i eficace de transplantare a

genelor. Оn cв?iva ani el a studiat retrovirusurile ?i s-a gвndit s?-i

restructureze оn a?a mod, ca ei s? serveasc? drept curieri sau vectori,

care transport? genele оn celule. Deoarece retrovirusurile о?i introduc pe

cale natural? genele оn celule, judeca savantul, putem s? le silim s? fac?

acela?i lucru ?i cu genele str?ine. Оn acest scop Mallighen ?i Verma, care

lucra ?i el asupra problemei ADA, «au suturat» o gen? de om cu o gen? de

virus ?i au contaminat cu ele celulele din cultur? Savan?ii ?i-au pus

sarcina de a crea o nou? specie de retroviru?i, care ar transporta genele

оn celulele omului ?i care ar fi оnchise trainic оn ele. Grupul lui

Mallighen s-a apucat de solu?ionarea acestei probleme complicate. Au fost

create din nou retrovirusuri, astfel ca s? se ob?in? o nou? unitate

infec?ioas?. Fiecare dintre acestea nu mai era оn stare s? nasc? noi

virusuri. Оn acest scop ei au оndep?rtat dintr-un virus genele responsabile

pentru crearea membranei proteice ?i le-au оnlocuit cu o gen? str?in?, dar

necesar? lor. Dintr-un alt virus, a?a-numitul virus-ajut?tor, ei au

оndep?rtat succesiunea genelor, care оi d?dea «semnalul» membranei proteice

de a se asambla cu ARN ?i a forma un nou virus. Cвnd aceste dou? «virusuri-

schiloade» sunt introduse оn celulele culturii, virusul ajut?tor asigur?

toat? munca necesar? de inserare оn celul? a virusului combinat (cu gena

str?in?), dar el singur nu se poate insera Vectorul, оns?, aflвndu-se оn

interior, nu se poate reproduce, deoarece оn ADN-ul s?u lipsesc

instruc?iile necesare pentru aceast? ac?iune ?i el (virusul cu gena

str?in?) r?mвne оnchis pe veci оn ADN-ul celular.

Mallighen afirm? c? acest sistem virotic de transportare a genelor este

perfect. El poate fi utilizat cu succes pentru transmutarea genelor omului

оn celulele omului cultivate in vitro.

Genele defectate, care provoac? ADA, precum ?i o alt? boal? – sindromul

Lesh-Nyhan, au fost de acum identificate ?i copiile lor normale pot fi

clonate оn laborator. Ele vor fi, probabil, primele care vor putea fi

tratate conform acestei metode. Savan?ii о?i imagineaz? aceast? procedur?

complicat?, оn mai multe etape, cam a?a: la оnceput medicul terapeut va

injecta acul seringii оn bazinul osos al pacientului, care sufer? de boala

incurabil? ?i va extrage o lingur? de celule de m?duv? osoas? Оn laborator

el va contamina aceste celule cu virusuri artificiale, care au fost

«recroite» оn a?a fel ca ARN-ul lor s? con?in? gena construit? ce оi

lipse?te bolnavului. Cвnd aceste celule vor fi din nou introduse

pacientului de la care au fost luate, genele ce func?ioneaz? corect о?i vor

asuma munca celor defectate, care nu-?i оndeplineau func?iile. Dac? se va

оntвmpla a?a, pacientul, probabil, se va оns?n?to?i ?i ?tiin?a va ob?ine o

nou? metod? de tratare a sute de alte boli ereditare.

Dar aceast? form? de terapie genic? va putea modifica garnitura de gene

numai a pacientului. Noile gene nu se transmit celulelor embrionare, din

care se formeaz? ovulele ?i spermatozoizii ?i, prin urmare, nu pot s? se

transmit? urma?ilor prin ereditate. Tratamentul bolilor genice prin

transferare pacientului a unor gene normale pare un lucru foarte simplu. Оn

realitate, оns?, terapia genic? este o procedur? atвt de fin?, оncвt numai

un num?r foarte mic de colective ?tiin?ifice din lume dispun de

cuno?tin?ele ?i experien?a necesar? pentru efectuarea unui asemenea

tratament. Unul dintre cele mai mari obstacole оn calea lor este g?sirea

unei metode sigure de inserare a genei normale оn celul? ?i nu numai оn

celul?, dar ?i оn locul unde se afl? genele defectate din ovulul (zigotul)

fecundat, de la care о?i ia оnceputul viitorul individ. Dar, оn pofida

tuturor acestor probleme ?tiin?ifice ?i sociale complicate, era terapiei

genice, conform p?rerii unice a savan?ilor, a оnceput ?i nu mai este

departe timpul cвnd medicii-geneticiieni nu numai vor оnl?tura simptomele

bolilor ereditare, dar vor corecta ?i defectele genelor care le provoac?.

XVII. ASPECTELE SOCIALE ALE INGINERIEI GENETICE

17.1 Cutia Pandorei sau consecin?ele imprevizibile ale ingineriei genice

Acest subtitlu al capitolului n-a fost ale s оntвmpl?tor. Anume a?a

definesc mul?i savan?i occidentali ingineria genetic?, avвnd оn vedere

consecin?ele cercet?rilor оn acest domeniu. Cu ajutorul ingineriei

genetice, precum am aflat, omenirea va putea, pe de o parte, s? ob?in? оn

viitorul apropiat cantit??i nelimitate de medicamente greu accesibile оn

prezent, noi forme de microorganisme, de plante ?i de animale – surse de

prosperitate a oamenilor. ?i, fapt ce prezint? o deosebit? importan??,

tocmai ingineria genetic? va putea izb?vi omenirea de povara genetic?,

adic? de bolile ereditare prin substituirea genelor patologice prin gene

normale.

Ingineria genic? deschide оn fa?a omenirii posibilit??i nelimitate. Pe de

alt? parte, оns?, ea prezint? un anumit pericol poten?ial atвt pentru om,

cвt ?i pentru оntreaga omenire. Оntr-adev?r, manipul?rile aflate la baza ei

ating mecanismele cele mai intime ale proceselor genetice ?i, оn ultim?

instan??, bazele moleculare ale vie?ii. Este clar c? rezultatele unor

experimente f?cute оn acest scop pot fi nea?teptate, precum s-a оntвmplat

оn anii cre?rii bombei atomice. O simpl? neglijen?? a experimentatorului

sau incompeten?a lui cu privire la securitatea muncii poate crea un pericol

pentru popula?ia unor ora?e ?i ??ri оntregi. Daune mult mai mari pot aduce

aceste metode, dac? vor nimeri оn posesia unor r?uf?c?tori sau militari?ti.

Caracterul global al acestui pericol este determinat, оn primul rвnd, de

faptul c? organismele cu care se fac de cele mai dese ori experien?ele оn

domeniul ingineriei genice sunt r?spвndite оn natur? (colibacilii tr?iesc,

de obicei, оn tractul intestinal al omului) ?i au capacitatea de a face

schimb de informa?ie genetic? cu confra?ii lor «s?lbatici». Aceast?

problem? cap?t? o importan?? deosebit de serioas?, deoarece оn urma acestor

manipul?ri este posibil? crearea unor organisme cu propriet??i genetice

absolut noi, care оnainte nu se оntвlneau pe P?mвnt ?i nu erau determinate

de evolu?ie. Оn prezent este imposibil a se prezice consecin?ele unor

astfel de experien?e.

Aceste considerente au provocat o mare оngrijorare a savan?ilor

progresi?ti ?i au stвrnit discu?ii aprinse cu privire la admisibilitatea ?i

condi?iile de realizare a experimentelor оn domeniul ingineriei genice.

Discu?ia s-a desf??urat оn jurul a dou? probleme fundamentale. Prima –

riscul poten?ial de experimentare cu moleculele recombinate de ADN. A doua

– mai ampl? – consecin?ele sociale posibile a utiliz?rii оn practic? a

ingineriei genetice.

Оn anul 1974 un grup de savan?i americani оn frunte cu P. Berg s-au

adresat savan?ilor din lumea оntreag? cu apelul de a supune unui moratoriu

cercet?rile ?tiin?ifice оn domeniul ingineriei genice, pвn? la convocarea

unei conferin?e interna?ionale.

Acest apel categoric adresat comunit??ii savan?ilor a fost sus?inut de

c?tre mul?i savan?i din оntreaga lume. Оn Anglia a fost creat? o comisie

pentru studierea experimentelor periculoase оn domeniul ingineriei genice,

care a ajuns la concluzia c? aceste cercet?ri trebuie interzise.

Moratoriul a fos1 respectat timp de 8 luni, pвn? la sfвr?itul lui

februarie 1975, cвnd s-a ?inut o conferin?? interna?ional? la Asilomar

(California, SUA), la care 140 de savan?i din 17 ??ri ale lumii, inclusiv

din fosta Uniune Sovietic?, au generalizat realiz?rile prealabile оn

studierea moleculelor recombinate de ADN, au discutat unele aspecte sociale

?i etice ale ingineriei genice, c?ile de prevenire a pericolelor poten?iale

ce ?in de ea ?i condi?iile ridic?rii moratoriului la dou? feluri din

experimentele cele mai periculoase.

Participan?ii la conferin?? au c?zut de acord c? majoritatea lucr?rilor

de construire a moleculelor de ADN recombinate pot fi efectuate, dac? se

iau m?surile de securitate necesare, care permit men?inerea organismelor

noi create оn limitele laboratorului. Principala metod? de prevenire a

pericolelor posibile оn ingineria genic? este ob?inerea de bacterii ?i

virusuri care nu s-ar оnmul?i decвt оn condi?ii de laborator. Оn

comunicatul final al conferin?ei s-a acordat o mare aten?ie asigur?rii

оntregului personal cu informa?ie absolut? despre experimente, despre

gradul lor de risc, precum ?i despre preg?tirea minu?ioas? ?i instruirea

personalului cu privire la m?surile de securitate, necesare оn efectuarea

diferitelor experimente cu un anumit grad de risc. Men?ion?m c? moratoriul

provizoriu asupra cercet?rilor оn domeniul ingineriei genice n-a fost

apreciat ?i interpretat de c?tre to?i savan?ii. Acest lucru s-a observat,

оn special, оn timpul consf?tuirii unionale cu privire la problemele

filozofice ale ?tiin?elor naturii (Moscova, 1985). Academicianul A. A.

Baev, luвnd cuvвntul la consf?tuire, a men?ionat c? manifestul care cheam?

s? se renun?e benevol la cercet?ri, a servit drept trambulin? pentru

campania ce s-a organizat contra ingineriei genice (оn temei оn SUA) ?i оn

care s-au оnrolat presa, radioul ?i televiziunea. Academicianul V. A.

Engelgard indica» c? оn calitate de adversari ai moratoriului s-au ridicat

adep?ii libert??ii «prospec?iunilor ?tiin?ifice», dar principiile s?n?toase

au оnvins, regulile de lucru respective au fost adoptate оn majoritatea

??rilor, uneori ele se transform? оn legi. A?a dar, - a оnceput savantul, -

datorit? ac?iunilor coordonate ale savan?ilor a fost prevenit un mare

pericol. «Moratoriul de la Asilomar» poate fi, pe drept cuvвnt, considerat»

un model de responsabilitate a savan?ilor оn fa?a pericolului care poate

atinge propor?iile unei mari calamit??i, propor?iile unei adev?rate crize.

Aceste opinii ale savan?ilor, cu toate c? nu sunt identice, au acela?i

numitor comun. Ele marcheaz? c? ingineria genic? a atras aten?ia omenirii

asupra necesit??ii controlului public, asupra celora ce se оntвmpl? оn

?tiin??, asupra pericolului care poate amenin?a оntreaga omenire. Оn

leg?tur? cu aceasta cunoscu?ii filosofi I. Frolov ?i B. Iudin au notat cu

mult spirit c? pвn? оn prezent to?i cei care au participat la discu?ii s-au

limitat doar la «drama de idei» ?i la «b?t?lii verbale». Dar cвte ne mai

a?teapt? оn viitor. ?i binele, dar, probabil, ?i r?ul. De aceea, cu toate

c? au fost adoptate anumite reguli ale lucr?rilor оn domeniul ingineriei

genice, nu face s? diminu?m pericolul ei poten?ial.

Subliniem c? mul?i speciali?ti occidetali ne «consoleaz?», declarвnd,

bun?oar?, c? arma de nimicire оn mas?, care poate fi creat? cu ajutorul

ingineriei genice, nu va fi mai pu?in distrug?toare decвt arma nuclear?.

Se discut? chiar posibilitatea cre?rii cu ajutorul ingineriei genice a

unui vaccin contra armei bacteriologice.

La 9 octombrie 1985, оn urma comunic?rii f?cute оn domeniul

biotehnologiei ?i ingineriei genice a оnceput «o er? nou?»: veterinarul

american R. S?lain a inoculat unor purcei un virus viu modificat prin

metode genetice. A fost primul caz de aplicare оn practic? a unui organism

viu, creat prin metode de inginerie genic?. Este greu de prezis cum se vor

desf??ura evenimentele оn viitor ?i care noi pericole amenin?? omenirea оn

urma unei asemenea practici.

Cine ?tie dac? problema virusului SIDA (sindromul imunodificitar

achizi?ionat) nu prezint? un fenomen asem?n?tor? Acest virus provoac? o

boal? grea, contra c?reia deocamdat? n-a fost g?sit nici un mijloc de

tratament radical, din care motiv ea s-a r?spвndit foarte repede ?i de ea

sufer? milioane de oameni оn lumea оntreag?.

Aproximativ peste ?apte ani dup? prima conferin?? de la Asilomar, acolo a

avut loc o alt? conferin??. La ea a fost discutat iar??i pericolul pe care

оl prezint? lucr?rile de inginerie genic?, nu pericolul biologic, dar cel

social: neоn?elegerile crescвnde оn sferele ?tiin?ifice ?i academice,

provocate de explozia interesului comercial fa?? de aceste cercet?ri.

Conform opiniei lui D. Dixon, specialist оn problemele politicii оn

domeniul ?tiin?ei, cauza organiz?rii acestei conferin?e a devenit

оngrijorarea opiniei publice оn leg?tur? cu cre?terea interesului comercial

?i racord?rii firmelor comerciale cu privire la aceste cercet?ri care se

desf??oar? оn primele linii ale biotehnologiei.

Ingineria genic? a оnceput a se utiliza ?i ca mijloc de politic? extern?.

Se declar? secret? informa?ia ce ?ine de biotehnologie, pentru a preveni

accesul ei «din motive de securitate». Оn anul 1979 guvernul SUA a stabilit

un control asupra exportului biotehnologiei, motivвnd c? produsele ?i

procesele biotehnologice pot fi utilizate оn ??rile du?mane Occidentului оn

calitate de poten?ial militar biologic.

??rile lumii, оn?elegвnd pericolul activit??ii lipsite de control оn

acest domeniu, precum ?i caracterul global al multor probleme ce apar aici,

au participat la multe conven?ii interna?ionale cu privire la reglarea

cercet?rilor ?tiin?ifice. Ele duc o lupt? activ? contra utili-z?rii

posibile a rezultatelor acestor cercet?ri оn scopuri militare, pentru

interzicerea armei biologice, la crearea c?reia оn principiu, pot fi

utilizate ?i metodele ingineriei genice, care poate fi mai periculoas?

decвt arma nuclear?. Ingineria genic? mai poate fi utilizat? ?i pentru a

insera оn colibacilul inofensiv genele de rezisten?? ale antibioticelor

cunoscute, iar apoi pentru a se insera оn ADN-ul genei purt?toare de toxina

diferit?, bun?oar?, sau a genei ce determin? sintetizarea toxinei

scorpionului.

Ast?zi posibilitatea cre?rii unei arme biologice a devenit o trist?

realitate. ?i biotehnologia, pe baza ingineriei genetice, nu poate r?mвne

indiferent? fa?? de principala problema a omenirii – crearea unei lumi pe

care s? n-o amenin?e r?zboiul bacteriologic.

Datoria sfвnt? a savan?ilor const? оn canalizarea tuturor eforturilor ?i

cercet?rilor spre binele omenirii, nu оn dauna ei. Doar neamul omenesc are

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30