Современная генетика

din ele — partenogeneza, a c?p?tat o larg? r?spвndire оn natur? la aproape

toate nevertebratele ?i la 24 specii de vertebrate — pe?ti, reptile,

amfibii. Оn cazul de fa?? ovulul оncepe diviziunea f?r? a fi fecundat ?i

pune оnceputul embrionului haploid, din care se dezvolt? un individ adult —

copia mamei. Aceast? metod? este cunoscut? ?i sub alt? denumire —

оnmul?irea virgin? a animalelor.

Ginogeneza — o alt? metod?, care se deosebe?te prea pu?in de

partenogenez?, se оntвlne?te ?i ea de multe ori оn natur?: la viermi,

pe?ti, amfibii. Оn cazul acesta activitatea pentru dezvoltare a oului ne

fecundat este realizat? de sperma altor specii оnrudite. N-are loc o

fecundare veridic?, de aceea, ca ?i оn exemplul precedent, toat?

descenden?a este de sexul feminin. La ob?inerea animalelor din celulele

sexuale conservate trebuie s? se asigure оnmul?irea lor continu?, adic?

trebuie s? se ob?in? o popula?ie de ambele sexe a acestor animale. Dac? s-

au p?strat celulele sexului homogametic, to?i indivizii din descenden?? vor

fi de acela?i sex (la majoritatea speciilor — numai femele). Iar dac? s-au

p?strat celulele sexului heterogametic, care con?in aproximativ оn

propor?ii egale sau cromozomi sexuali masculini (Y) sau feminini (X), nu e

exclus ca ele s? fecundeze selectiv ovulul din eprubet? ?i s? se ob?in?

embrionii de sexul dorit. Am mai men?ionat c? оn anul 1983 la Institutul

unional de cercet?ri ?tiin?ifice оn domeniul оnmul?irii ?i al geneticiii

animalelor agricole al Academiei agricole unionale s-a ob?inut un vi?el

dintr-un ovul crescut ?i fecundat оn eprubet?.

Crearea b?ncii de embrioni congela?i are, desigur, mai multe avantaje оn

compara?ie cu b?ncile celulelor sexuale. Оn primul rвnd, aceast? banc?

permite p?strarea genotipului ambelor sexe, adic? a masculilor ?i femelelor

speciei оn dispari?ie. Оn rвndul al doilea, se simplific? mult procedura

ob?inerii animalelor din embrionii congela?i, – r?mвne doar s? fie

implanta?i la femelele de aceea?i specie sau de specie apropiat?, оnrudit?.

Aceast? metod? permite, fapt ce prezint? o mare importan??, a se ob?ine

puii оn timpul cel mai favorabil al anului.

Ea are o mare importan?? practica ?i pentru p?strarea fondului genetic

de. valoare al animalelor agricole cunoscute prin caracterele lor economice

utile. Afar? de aceasta , dispare necesitatea de transportare оn alte

raioane sau regiuni a animalelor de ras? pentru selectarea turmelor. Оn

acest scop sunt utilizate micile vase Diuar, оn care viitoarea ras? poate

fi expediat? оn stare congelat? ca prin po?t? оn orice col?i?or nu numai al

??rii, ci ?i al оntregii lumi. A?a se procedeaz? оn Australiea, unde

aducerea embrionilor congela?i este singura metod? de importare a

animalelor de ras?.

Metoda de transplantare a embrionilor congela?i ai animalelor ce s-au

remarcat prin calit??ile lor femelelor animalelor de rase inferioare

permite realizarea mai ra?ional? ?i оntr-un ritm mai accelerat a

poten?ialului genetic al raselor de mare randament. Se ?tie c? fiecare ras?

de vite cornute mari se deosebe?te de cealalt? prin numeroase caractere,

inclusiv prin produc?ia de lapte. De exemplu, vacile de ras? neagr? b?l?at?

cu alb produc оn mediu 3400–3800 kilograme de lapte anual. Оn cele mai bune

gospod?rii produc?ia de lapte a acestei rase este mult mai mare: 5200–6500

litri. Printre vacile de aceast? ras? exist? ?i recordiste. Vaca Dora

(cresc?toria din Vilnus), de exemplu, d? 12605 kilograme de lapte. Volga

(sovhozul «Rossia», regiunea Celeabinsc) – 17517 kilograme, iar Blanca

(Cuba) – chiar 24750 kilograme. Vaca Bicer Arlinda Elen de ras?

Hol?teinfriz? (SUA) оn 305 zile din a cincia lacta?ie a dat o produc?ie de

lapte record – 25747 kilograme. Cum s? nu admir?m productivitatea

fenomenal? a acestor recordiste! Fiecare dintre ele prezint? o fabric? de

lapte. Ultima din recordistele citate produce 10 c?ld?ri de lapte zilnic.

E fireasc? оntrebarea: este ra?ional oare s? folosim aceste vaci

remarcabile drept donatoare de lapte? N-ar fi oare mai bine s? fie

transformate оn fabrici cu produc?ie оn flux de embrioni, folosind оn acest

scop totodat? sperma conservat? оn borcane a animalelor de mare randament.

S? examin?m, оn sfвr?it, ?i cazul оn care din specia disp?rut? au r?mas

numai celulele somatice. Sarcina de a restabili specia din ele este, de

bun? sam?, cea mai grea, dar, оn principiu, realizabil?. Am mai relatat

despre metoda transplant?rii nucleelor celulelor somatice оntr-un ovul al

c?rui nucleu a fost оn prealabil оndep?rtat sau inactivat. Оn anul 1981 a

ap?rut prima comunicare despre na?terea puilor de ?oareci, care s-au

dezvoltat exclusiv din nucleul transplantat. Acest lucru a fost dovedit

prin aplicarea marcajului genetic: ovulele au fost luate de la ?oarecele

negru, embrionii din care au fost luate nucleele – de la ?oarecele cenu?iu

?i, оn sfвr?it, «mama adoptiv?» a fost alb?. S-au n?scut ?oricei cenu?ii,

fapt ce a servit drept dovad? c? ei s-au dezvoltat din nucleul

transplantat.

Pentru reproducerea animalelor din celule somatice conservate sunt

necesare, оns?, transplant?ri interspecifice ale nucleelor. ?i ele, оn

principiu, sunt pe deplin realizabile. Astfel de experien?e au fost

efectuate asupra pe?tilor oso?i ?i amfibiilor. Оn multe cazuri hibrizii

nucleari-citoplazmatici ob?inu?i au fost viabili.

A?a dar, visul c? оn viitorul apropiat aceast? metod? va permite nu numai

reоnvierea speciilor disp?rute, ci ?i ob?inerea animalelor identice din

punct de vedere genetic prin transplantarea оn diferite ovule a nucleelor

aceluia?i organism devine o realitate. Acest lucru deschide selec?iei

perspective ademenitoare. Pe aceast? cale se pot p?stra un timp nelimitat

?i genotipurile ce prezint? o deosebit? valoare, transplantвnd succesiv

nucleele din genera?ie оn genera?ie.

Se ?tie c? оnmul?ind оn mod obi?nuit descenden?a unei recordiste ultima

devine mai bun? decвt celelalte vaci, dar rar de tot atinge nivelul mamei,

pentru c? are numai jum?tate din cromozomii mamei ei, cealalt? jum?tate o

prime?te de la tat?. S? nu uit?m de asemenea c? productivitatea ?i gr?simea

laptelui, ca ?i celelalte caractere ale productivit??ii, se determin?

printr-un num?r foarte mare de gene dislocate оn diferi?i cromozomi.

Deaceea оmbinarea cromozomilor ?i a genelor, ob?inute de la ambii p?rin?i,

rareori este tot atвt de reu?it? precum a fost la mama recordist?.

Altfel ar evolua lucrurile dac? s-ar ob?ine vaci cu o garnitur? de

cromozomi identic? cu cea a recordistei. Acest lucru e posibil, оns? numai

dac? se vor transplanta nucleele ei. Dac? aceasta va deveni o realitate,

va deveni posibil? ob?inerea de la un animal a unui num?r nelimitat de

urma?i, care, оn sens genetic, n-ar mai fi urma?i, ci ni?te surori gemene

ale vacii de la care, f?r? a-i aduce vre-o daun?, s-ar lua unele nuclee ale

celulelor somatice pentru a fi transplantate оn ovule str?ine.

Оn ultimul timp, datorit? succeselor ob?inute de ingineria genic?, a

devenit posibil? crearea de b?nci sau biblioteci de gene aparte. ADN-ul

este separat din organism, moleculele cu ajutorul fermen?ilor de restric?ie

sunt t?iate оn fragmente, care apoi se insereaz? оn plazmide vectoriale.

Acestea la rвndul lor se insereaz? оn celule bacteriale, care apoi se

sorteaz? оn cloni aparte, fiecare con?inвnd cвteva gene.

Anume totalitatea acestor cloni prezint? biblioteca de gene a acestui

organism. Оn realitate, оns?, aceasta va fi o bibliotec? f?r? catalog ?i

noi vom fi nevoi?i s? separ?m din milioanele de bacterii doar pe acelea ce

con?in gena care ne intereseaz?. Pentru a solu?iona aceast? problem?

(«c?utarea acului оn stogul de fвn») se folosesc zonduri speciale,

utilizarea c?rora se bazeaz? pe principiul complimetarit??ii acizilor

nucleici. Un astfel de zond e alc?tuit dintr-o molecul? de ARNi radioactiv,

specific? pentru gena, care trebuie selectat?. Avвnd molecule de acest fel

se poate efectua scriningul biblitecii de gene, ceea ce ne permite

selectarea acelei bacterii, care con?ine ADN-ul complimentar zondului dat.

Pentru organismele superioare, оns?, trebuie selectate cвteva milioane de

astfel de cloni, c?ci numai a?a se poate asigura p?strarea memoriei

genetice a speciei оn dispari?ie.

Pe viitor informa?ia genetic? a speciei va putea fi оnscris?, probabil,

оn form? de tabel. Lucr?rile de descifrare a succesiunilor ADN-ului, de

separare a genelor individuale, efectuate pe parcursul ultimilor ani,

indic? posibilitatea determin?rii structurii primare a moleculelor ADN de

orice lungime. Mai mult chiar, natura chimic? a ADN-ului permite

sintetizarea lui оn condi?ii de laborator. Trebuie s? se ?tie doar оn ce

ordine sunt dispuse nucleotidele pe fiecare sector al ADN-ului. Оn acest

scop au fost deacum create cвteva tipuri de a?a-numitele «ma?ini genice». O

asemenea ma?in? sintetizeaz? оn mod automat fragmente de ADN cu o lungime

de 40 de nucleotide: viteza - 1 nucleotid оn 5-6 minute. Ma?ina este

compus? dintr-un microprocesor, rezervoare cu nucleotide, reagen?i ?i

solu?ii necesare оn anumite etape de lucru, pomp? ?i corpul pompei оn care

se produce sinteza ADN-ului. Corpul pompei este plin de bile foarte mici de

cremene, care servesc ca baz? ?i pe care se «asambleaz?» molecula ADN.

Succesivitatea necesar? a nucleotidelor se оntroduce оn memoria ma?inii cu

ajutorul unui pupitru cu clape. Microprocesorul umple corpul de pomp?

succesiv cu nucleotide, care la un cap?t sunt blocate, pentru a se asigura

adi?ionarea nucleotidului nou introdus numai la capitul lan?ului оn

cre?tere

Astfel, utilizвndu-se «ma?inile genice», se va putea reproduce fondul

genetic al oric?rei specii pe baza informa?iei ob?inute despre ea оn form?

de tabel.

Оns?, pвn? la aplicarea acestor metode de descifrare complet? a genomului

?i clasificarea lui pentru urma?i, multe specii nu vor mai exista pe

P?mвnt. De aceea este de o mare importan?? asigurarea fix?rii materialului

genetic al ultimelor exemplare ale speciilor de animale оn dispari?ie sub

form? de ?esuturi ?i celule pentru ca ele s? poat? fi reоnviate оn viitor.

Cu aproape 200 de ani оn urm? оn apele litorale ale insulelor Comandore

fauna mondial? a pierdut o specie unic? de mamifer marin – vaca de mare. Оn

prezent ne d?m seama cu regret ce scump fond genetic a disp?rut odat? cu

nimicirea acestor vaci: a fost singura specie din micul grup al mamiferelor

marine erbivore criofile. Dac? оn prezent ar exista vaca de mare, problema

proteinei animaliere ar fi solu?ionat? destul de simplu, prin cre?terea

acestor animale pe «p??unile» gigantice subacvatice naturale ale

litoralului m?rilor Orientului Оndep?rtat.

XVI. INGINERIA GENIC? ?I SISTEMATICA

15. Genele ?i sistematica

Din cele mai vechi timpuri omul оncerca s? clasifice, s? pun? оntr-o

anumit? ordine, оntr-un sistem оntreaga varietate de organisme ce populeaz?

planeta noastr?. Aceste оncerc?ri se f?ceau la timpuri diferite, оn mod

diferit. Sistematica este ?tiin?a despre varietatea organismelor ?i

clasificarea lor pe baza originii evolutive sau a rela?iilor de rudenie

dintre ele. Mult timp principalul criteriu de clasificare a organismelor

era cel morfologic. Savan?ii studiau asem?n?rile ?i deosebirile dintre

organisme conform caracterelor exterioare vizibile ?i determinau pe baza

acestora apartenen?a lor la o anumit? specie.

Aceast? orientare оn sistematic? a fost numit? pe vremuri fenosistematic?

(fen – caracter, adic? clasificare conform caracterelor externe).

La оnceputul secolului nostru existau deja informa?ii care indicau c?

organismele ce fac parte din diferite specii nu se deosebesc totdeauna clar

dup? fenotip (morfologic).

Datorit? acestui fapt savan?ii au оnceput s? caute un nou criteriu de

determinare a apartenen?ei organismelor la diferite specii ?i au procedat

la studierea cariotipului lor (num?rul ?i particularit??ile morfologice ale

structurii cromozomilor lor). S-a constatat c? la organismele din aceea?i

specie cariotipul este identic, pe cвnd la speciile diferite el este

divers. Cariotipul a оnceput s? fie considerat drept unul din principalele

criterii ale speciei. Оn sistematic? a ap?rut o nou? orientare –

cariosistematica.

Cu ajutorul metodelor cariosistematicii s-au ob?inut date de valoare,

care permit оn?elegerea multor mecanisme evolutive ?i solu?ionarea multor

probleme ce apar оn procesul de clasificare a plantelor ?i animalelor

superioare.

Metodele cariosistematicii ?i fenosistematicii s-au dovedit, оns?,

nepotrivite pentru determinarea organismelor din regnul al treilea – regnul

microorganismelor. Microorganismele n-au оn celule un nucleu bine reliefat,

cu atвt mai mult, ele n-au cromozomi. Multe caractere fenotipice (forma,

tipul de cili, structura peretelui celular ?. a.) pentru diversele lor

grupuri au ap?rut pe parcursul evolu?iei оn mod independent, dвnd na?tere

unor forme morfologice asem?n?toare, dar ne оnrudite din punct de vedere

genetic. De aceea clasificarea conform fenotipului a constituit doar primul

pas. Al doilea a fost clasificarea dup? genotip, care are valoare cognitiv?

?i de pronosticare mult mai mare decвt fenotipul.

La formele prenucleare ale organismelor (la procario?i) aparatul genetic

este reprezentat prin molecule aparte de ADN. Studierea lor a ajutat mult

la оn?elegerea particularit??ilor structurii genotipilor tuturor grupelor

de organisme. Aceste cercet?ri au avansat rapid din momentul descoperirii

unei clase noi de fermen?i – a restrictazelor – instrumente principale оn

ingineria genic?. Studierea structurii moleculare a genotipului

organismelor a devenit mai pu?in dificil? datorit? folosirii acestor

fermen?i capabili s? provoace rupturi оn succesivit??ile specifice ale ADN-

ului. Astfel a ap?rut оnc? o orientare оn ?tiin?? – genosistematica. Anul

ei de na?tere se consider? 1960, atunci cвnd a fost publicat? lucrarea lui

A. N. Belozerschii ?i a discipolului s?u A. S. Spirin cu titlul:

«Componen?a acizilor nucleici ?i sistematica». Оn aceast? lucrare s-a f?cut

prima оncercare de a examina оn plan comparativ toate cuno?tin?ele

fragmentare ?i dispersate acumulate pвn? atunci cu privire la structura de

ADN al celor mai diverse grupuri de organisme.

Astfel, оncepвnd cu observ?ri aparte, s-a f?cut primul ?i cel mai

important pas spre formarea principiilor de baz? ale genosistematicii.

Principalul obiect pe care оl analizeaz? genosistematica este structura

molecular? a genotipului. Cu cвt organismul este mai complex, cu atвt

aparatul s?u genetic con?ine mai mult ADN.

Faptul c? structura ADN-ului este diferit? la specii diferite genereaz?

anumite dificult??i. Am mai men?ionat ce cantitate uria?? de informa?ie

con?ine o singur? molecul? de ADN. ?i dac? ne punem drept scop s? compar?m

materialul genetic al sec?rii cu cel al maz?rii, ne vom pomeni оn situa?ia

savantului, care ar оncerca s? compare sensul informa?iei ce o con?in dou?

biblioteci tematice, compuse din cвteva zeci de mii de volume fiecare ?i

scrise оntr-o limb? pe care el n-o cunoa?te.

Odat? cu evolu?ia cercet?rilor оn domeniul ingineriei genice au ap?rut,

оns?, posibilit??i noi pentru u?urarea muncii savan?ilor genosistematici.

Fragmentarea moleculelor mari de ADN ?i determinarea structurii primare a

fiec?rui fragment a accelerat оn mare m?sur? nu numai procedura secven?rii

(descifrarea succesiunii nucleotidelor) acestor molecule, ci chiar analiza

structurii fine a fiec?rei gene aparte ?i succesiunii disloc?rii lor de-a

lungul moleculelor de ADN.

15.2 Gradul de оnrudire genetic?

Care sunt metodele prin intermediul c?rora se studiaz? structura

molecular? a genotipului?

La оnceput compararea programelor genetice ale organismelor se f?cea pe

baza unei singure presupuneri, absolut logice: cu cвt genotipurile sunt mai

diverse, cu atвt frecven?a unor nucleotide aparte din ADN se deosebe?te mai

mult. Cu alte cuvinte, savan?ii au оnceput a determina diferitele organisme

conform structurii nucleotidice a ADN-urilor comparate.

Structura nucleotidic? a ADN-ului este determinat? cel mai bine prin

metoda direct?: prin hidroliz? moleculele polimere ale ADN-ului sunt

transformate оntr-o solu?ie de nucleotide ?i se determin? partea lor

molar?. Ca urmare se afl? care este frecven?a adeninei (A), guaninei (G),

citozinei (CE) ?i timinei (T) оn ADN-ul cercetat.

S? ne amintim c? aceste baze se cupleaz? selectiv: G – CE ?i A – T. Prin

urmare, bazele care formeaz? perechi se vor оntвlni cu o frecven??

constant?. Prin ce se pot deosebi atunci unii de al?ii diferi?ii ADN?

R?spunsul este univoc: ei se deosebesc dup? frecven?a acestor perechi

complementare de nucleotide ?i dup? ordinea disloc?rii lor оn molecule.

Este bine venit a exprima partea molar? a perechilor de nucleotide G – CE

?i A – T оn procente. Dac? este scris c? structura nucleotidic? a unui ADN

este 42 mol.% G–CE, оnseamn? c? la fiecare sut? de perechi de nucleotide 42

de perechi dintre acestea vor fi G – CE ?i, respectiv, 58 de perechi A -T.

Genotipurile se pot deosebi ?i dup? num?rul sumar de perechi nucleotide

din molecula ADN-ului. Aceste deosebiri оn con?inutul cantitativ al ADN-

ului sunt foarte importante: ele reflect? direct volumul informa?iei

genetice, p?strat? оn genotipul organismelor.

Metoda direct? de determinare a structurii nucleotidice a ADN-ului este

simpl? ?i comod?, de?i are ?i neajunsuri: pentru a efectua analiza e nevoie

de mult ADN, iar analiza оns??i dureaz? cвteva zile. De aceea оn acest scop

sвnt folosite uneori diferite metode indirecte. Оn laboratorul lui P. Doti

de la Universitatea Harvard (SUA) a fost studiat fenomenul denatur?rii

moleculelor ADN. Dac? vom lua o solu?ie de ADN polimer ?i o vom оnc?lzi, la

atingerea unei anumite temperaturi critice, vor оncepe s? se desfac?

leg?turile оntre cele dou? catene. Dac? temperatura va continua s? creasc?,

partea acestor leg?turi rupte va spori tot mai mult ?i оn cele din urm? se

va produce diviziunea moleculelor оn dou? jum?t??i complementare – ADN-ul

denatureaz?.

La r?cirea solu?iei ambele jum?t??i о?i vor g?si partenerul complementar

?i se va produce restabilirea structurii ini?iale a spiralei duble –

renaturarea ADN-ului.

S-a observat c? ADN-ul cu componen?? diferit? denatureaz? la temperaturi

diferite: cu cвt partea molar? a perechilor G-CE este mai mare, cu atвt

este mai mare ?i temperatura de denaturare a ADN-ului.

Pentru denaturarea structurii prin aceast? metod? se cere foarte pu?in

ADN ?i experien?a dureaz? pu?in timp. Practica sistematicii genice a

demonstrat c? determinarea structurii ADN-ului este o metod? sigur? de

determinare a asem?n?rilor ?i deosebirilor la stabilirea genotipurilor.

Printre numeroasele grupuri de animale ?i plante exist? unele cu o

morfologie foarte s?rac? ?i, prin urmare, cu un num?r mic de caractere

adev?rate pentru comparare. Cu totul alta este situa?ia cвnd orice

tr?s?tur? caracterizeaz? tot ADN-ul genotipului. Оn el se reflect? ca оntr-

o oglind? particularit??ile structurale ale tuturor genelor, care determin?

formarea fenotippului.

La toate formele оnrudite structura ADN-ului este foarte asem?n?toare,

dar asem?narea structurilor nu indic? direct asupra оnrudirii. Totodat?

gradul de deosebire ?ine direct de gradul de divergen??, de deosebire a

formelor de organisme comparate ?i grupurilor lor naturale (gen, familie,

ordin).

Pentru determinarea gradului de deosebire dup? ADN au fost propuse ?i

alte metode, bazate pe determinarea cantitativ? a combina?iilor specifice

de nucleotide, ce se оntвlnesc оn ei. Cea mai simpl? combinare este o

pereche de nucleotide care stau al?turi оn catena ADN-ului. Оn fiecare

serie de experien?e unul din cele patru tipuri de nucleotide era marcat cu

fosfor radioactiv. Compararea rezultatelor acestor experien?e oferea

posibilitatea de a determina frecven?a tuturor celor 16 combina?ii posibile

de perechi de tipul:

A–A, A–G, A–C, A–T;

T–T, T–A, T–G, T–C;

G–G, G–A, G–C, G–T;

C–C, C–A, C–G, C–T.

Cвnd determin?m frecven?a acestor combina?ii de nucleotide оn ADN, noi

proced?m deja la analiza «silabelor» оn textele programelor genetice.

Elaborarea acestei metode оn laboratorul lui A. Cornberg (SUA) a

prezentat un pas оnainte оn practica sistematicii genice. Posibilitatea

coinciden?ei ocazionale a textelor programelor genetice (dup? frecven?a

celor 16 tipuri de «silabe») este mult mai mic? decвt frecven?a unor

nucleotide aparte.

Dar, cu toate acestea, metodele de determinare a structurii ADN-ului ?i a

frecven?ei unor grupuri aparte de nucleotide sunt pu?in eficace la

compararea materialului genetic al speciilor legate strвns prin rudenie

filogenetic?.

Modific?rile оn structura ADN-ului se acumuleaz? pe parcursul evolu?iei

foarte lente, de aceea оn grupele evolutive tinere (animalele vertebrate,

plantele superioare) diferitele specii se deosebesc pu?in prin «sensul»

informa?iei genetice, оnsumate оn genotipii lor. Cunoscutul savant A.

Antonov afirm? оn acest sens c? deosebirile оn structura complexului de

gene, responsabile pentru dezvoltarea aripii liliacului ?i a mвnii omului,

sunt foarte mici ?i, de fapt, nu sunt sesizate de metodele descrise mai

sus.

Оn arsenalul metodelor genosistematicii exist? ?i metode prin intermediul

c?rora se poate cerceta ADN-ul speciilor оnrudite foarte aproape.

Оn laboratorul lui P. Dati au fost elaborate ?i bazele unei anumite

metode de comparare a structurilor diferi?ilor ADN. La elaborarea acestei

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30