Современная генетика

grame de protein?. 300 kg de celule de drojdii timp de o zi dau un spor de

25-30 mii kg de mas? biologic?, care con?ine II-13 mii kg ^ protein?

digerabil?.

A?a dar, drojdiile acumuleaz? proteina de 100 mii de ori mai repede decвt

organismul unui taur! Iar bacteriile acumuleaz? masa biologic? ?i proteina

оnc? mai repede decвt drojdiile. Dup? componen?a lor chimic? ?i structural?

aminoacizii bacteriilor, drojdiilor, plantelor superioare ?i animalelor

sunt absolut identice. De aceea insuficien?a de lizin?, bun?oar? din

furajul animalelor sau din hrana omului, poate fi compensat? cu lizina

bacteriilor sau drojdiilor. ,

?tiin?a contemporan? a pus оn fa?a industriei de producere a celulelor

vii, a microbiologiei industriale, care оn strвns? alian?? cu industria

biochimic? ?i ingineria genic? formeaz? esen?a noii orient?ri, numit?

biotehnologie - sarcini complicate, de mare r?spundere.

S? examin?m acum оn mod separat unele aspecte ale biotehnologiei.

11.2 Ingineria genic? оn natur?: transforma?ia, transduc?ia ?i conjugarea

la bacterii

Pentru a оn?elege de ce microbii au ocupat un loc atвt de important оn

ingineria genic?, trebuie s? ne familiariz?m m?car оn mod sumar cu metodele

uimitoare ale schimbului de informa?ie genetic?, ce le ofer? natura.

Celula bacterian? se оnmul?e?te prin diviziune simpl?, dup? care dintr-o

celul? se formeaz? dou?, ?i fiecare din ele con?ine cвte un analog propriu

al nucleului - nucleoidul cu ADN. De aceea celula matern?, оnainte de a se

diviza, trebuie s? aib? dou? genome absolut identice, cu alte cuvinte, dou?

molecule de ADN pentru a transmite una din ele celulei-fiice, iar pe

cealalt? pentru a o p?stra pentru ea. Оnainte de diviziune celula matern?

оncepe s? sintetizeze o copie exact? a ADN-ului s?u. Deoarece procesul

оnmul?irii se produce f?r? participarea organismului masculin, celula-fiic?

poate mo?teni numai genele mamei - supersolitare. Ambele celule noi vor

avea garnitura de gene absolut identice.

Va fi bine dac? a?a va continua din genera?ie оn genera?ie? Din cauza

lipsei unor combina?ii ereditare noi selec?ia natural? ar fi r?mas

«?omer?», ?i evolu?ia n-ar fi avut nici o ?ans? de reu?it?.

Pentru a оnfrunta aceste piedici, natura a inventat multe metode, uneori

uimitor de simple, alteori cu adev?rat fantastice.

Оn primul rвnd, trebuie s? ne oprim asupra muta?iilor, adic? a

modific?rilor оn gene, mo?tenite de celulele-fiice. Despre ele am mai

pomenit. Dar probabilitatea muta?iilor este foarte mic?. Afar? de aceasta,

majoritatea lor covвr?itoare poate provoca apari?ia unor caractere ?i

оnsu?iri inutile sau d?un?toare, descenden?a purt?toare de aceste muta?ii

va fi rebutat? pe parcursul selec?iei naturale. Tocmai aici va apare o alt?

descoperire - recombinarea - un mijloc de schimb de informa?ie genetic? оn

lumea fiin?elor invizibile.

Ca exemplu al acestui fapt serve?te capacitatea uimitoare a bacteriilor

de a absorbi din mediul ambiant gene str?ine ?i de a degaja gene proprii.

Acest fenomen se nume?te transformare. Despre el am men?ionat оn leg?tur?

cu studierea naturii factorului care оl provoac?.

Transformarea este larg r?spвndit? printre procario?i оn condi?ii

naturale. Ea se produce ?i оn celulele animalelor.

Cum se produce ea оn cazul transform?rii schimbului de material genetic?

Оn ciclul de dezvoltare a bacteriilor apare periodic o stare specific?,

cвnd peretele celulei devine penetrabil pentru ADN. Celula care se afl? оn

aceast? stare se nume?te celul? competent?, ea poate absorbi din mediul

ambiant o mare cantitate de ADN str?in. Оn acest scop la оnceput ea secret?

o protein? special?, care se fixeaz? de acest ADN, dup? care ADN-ul str?in

este absorbit de celul? asemeni unei frвnghii, care este tras? de un cap?t

al ei.

Ce se оntвmpl? cu ADN-ul absorbit? Aproape jum?tate din el se scindeaz?,

iar partea r?mas? este utilizat? ca surs? pentru noua informa?ie genetic?.

La оnceput sistemele fermentative ale celulei desfac spirala dubl? a ADN-

ului, apoi o descheie ca pe un fermoar ?i taie оn fragmente filamentele de

transmisie ob?inute. Dup? aceasta pe fiecare fragment care con?ine o gen?

«str?in?» se construie?te ca pe o matri?? a doua caten? ?i sectorul

spiralei duble construit astfel se оncorporeaz? оn ADN-ul propriu al

celulei (fig. 24).

La bacterii, spre deosebire de eucario?i, schimbul de blocurile gata de

ADN este posibil nu numai оntre organismele de aceea?i specie, dar ?i оntre

cele de diferite specii, genuri ?i chiar familii, ceea ce conduce la

modific?ri оn salturi a propriet??ilor ereditare.

Cercetarea multilateral? a procesului natural de transformare la bacterii

a deschis calea spre dirijarea eredit??ii microorganismelor, spre ingineria

genetic? ?i biotehnologia modern?.

Transformarea determin? schimbul direct, nemijlocit de blocuri de ADN

оntre bacterii. Dar, dup? cum s-a constatat, natura mai are alte metode de

transmitere a genelor de la o bacterie la alta.

Deseori transportori de gene aparte sau de grupe de gene sunt virusurile

bacteriilor - bacteriofagii. Nu fagii agresivi (virulen?i) care, p?trunzвnd

оn celul? ?i оnmul?indu-se rapid, o devoreaz?, o distrug, o dizolv? ?i,

dup? ce ies din ea, se n?pustesc asupra celorlalte celule. Ace?tia sunt

fagi pa?nici, a?a-zi?ii fagi modera?i.

Dup? ce au p?trunse оn celul?, ADN-ul ?i ARN-ul lor se insereaz? оn

cromozomul bacteriei-gazde ?i se transform? оn profag. Fagul inserat оn

genomul bacteriei (sau care i s-a aliniat) se оnmul?e?te оmpreun? cu el, se

transmite celulelor-fiice ?i se r?spвnde?te оn felul acesta оn popula?ie.

El nu-?i pierde оns? «esen?a sa de lup». Dac? aceste celule nimeresc оn

condi?ii nefavorabile, fagul о?i leap?d? «blana de oaie» ?i distruge celula

ce l-a ad?postit. Separвndu-se de genomul celulei, fagul ia cu dвnsul o

parte din genele acestuia. Fagul moderat, molipsind o alt? celul? ?i

inserвndu-se оn ADN-ul ei, aduce aici atвt genele sale, cвt ?i pe cele

«furate» de la fosta gazd?, modificвnd ereditatea celulei noi. Acest proces

se nume?te transduc?ie (fig. 25).

Cunoscutul geneticiian S. Alihanean a men?ionat c? genele donorului

transdus (adic? transportate de fag) joac? rolul de «pasageri», iar fagul -

de «birjar».

Lipsa la bacterii a оnmul?irii sexuale, caracteristice pentru eucario?i,

p?rea c? trebuie s? complice recombinarea genelor ?i a genomilor, prin

urmare ?i evolu?ia lor. Dar descoperirea la bacterii a factorilor

acromozomici - a plazmidelor, a introdus оn aceste no?iuni rectific?ri

serioase.

Savan?ii au constatat c? plazmidele sunt independente de ADN-ul celulei

?i se pot оnmul?i independent, pot produce propriile copii. Plazmidele

poart? gene care atribuie bacteriilor unul sau cвteva caractere, de exemplu

rezisten?? fa?? de preparatele medicamentoase, capacitatea de a sintetiza

substan?e active biologice ?. a. Plazmida poate, ca ?i fagul, s? se

insereze оn cromozomul bacteriei ?i s? se separe de el. Asemenea fagului ea

las? uneori оn cromozom una sau cвteva gene proprii ?i la plecare duce cu

ea gene ale gazdei. Оn aceste cazuri propriet??ile ereditare atвt ale

celulei, cвt ?i ale plazmidei se pot modifica оn mod sim?itor.

S-a stabilit c? un tip aparte de plazmide, numite plazmide F (prima

liter? a cuvвntului englez «fertilitate»), reconstituie la bacterii un

proces asem?n?tor celui sexual.

Bacteria purt?toare a plazmidei F ob?ine оnsu?iri ale donatorului - ale

organismului masculin. Pe suprafa?a acestei celule se formeaz? vilozit??i

fine. Cвnd se оntвlne?te cu bacteria feminin? care nu con?ine plazmida F

(ea e numit? recipient), bacteria masculin? «se c?s?tore?te» cu ea, se

conjug?, unindu-se cu ajutorul vilozit??ilor tubulare. Pe aceast? punte

prin canalul de vilozit??i acoperit se transmite plazmida F ?i celelalte

plazmide din celula donatorului оn celula feminin?.

Dac? plazmida F s-a оncorporat оn componen?a cromozomului celulei,

lucr?rile se vor desf??ura altfel. Plazmida provoac? ruptura uneia din

cele dou? catene de ADN ale donatorului, dup? care cap?tul liber al

filamentului cu o singur? caten? se transmite prin canalul vilozit??ii

bacteriei feminine, unde pe acest filament se sintetizeaz? оndat? catena

lui complimentar?. Plazmida F parc? оmpinge din spate segmentul ADN al

donatorului spre celula feminin?. Astfel cu ajutorul plazmidei F cromozomul

donatorului sau o parte a lui se transmite celulei recipientului. Ultima

cap?t? caractere noi, care nu-i sunt proprii dar care sunt caracteristice

pentru donator. Astfel se produce amestecul caracterelor ereditare a dou?

celeule diferite. Nu este oare acesta un adev?rat proces sexual? (fig. 26)

Plazmida F, dup? ce a p?truns оn celul?, produce curвnd descenden?a sa.

Celula feminin?, devenind st?pвn? a acestei plazmide, ce transform?

imediat оn donator ?i, venind оn contact cu alte celule feminine, le

transmite factorul F ?i celorlalte plazmide, de exemplu plazmida R.

Plazmida R (R-prima liter? a cuvвntului «rezistent») transmite bacteriilor

imunitatea pentru antibiotice ?i pentru preparate medicamentoase.

R?spвndirea fulger?toare a acestor plazmide prezint? un mare pericol, c?ci

chiar cele mai eficiente mijloace de combatere a bolii infec?ioase devin

inactive. Оn asemenea cazuri trebuie schimbat de urgen?? medicamentul.

Interesant este c? оn condi?ii naturale plazmidele R se оntвlnesc mai des

la bacteriile patogene, contra c?rora medicii duc o lupt? permanent?. Prin

urmare, utilizarea larg? a antibioticelor contribuie la selectarea unor

bacterii, ce con?in plazmida R, rezistente la aceste antibiiotice.

Bacteriile manifest? caractere de mare valoare оn lupta pentru existen??

оn condi?ii extremale. Oare nu este aceasta o adev?rat? inginerie genic?,

care are loc оn natur??

Toate aceste unelte ?i subterfugii fine, elaborate de lumea microbilor pe

parcursul luptei crвncene pentru existen??, trebuie оnsu?ite pentru a-i

sili pe muncitorii microlumii s? ac?ioneze spre binele omenirii.

11.3 Ameliorarea microorganismelor

Separarea din natur? a unor noi tulpini de microorganisme prezint? doar

prima etap? a muncii de selec?ionare. Sarcina ulterioar? const? оn

ridicarea gradului de calificare a acestor microbi. Savan?ii caut? s?

оn?eleag? nu numai tehnologia proceselor de sintez? ?i de metabolism din

celulele microbiene, dar ?i s? descopere posibilit??ile de ameliorare, de

perfec?ionare, de modificare a eredit??ii cu ajutorul acestei tehnologii.

Оn prezent industria microbiologic? utilizeaz? mii de tulpini ale multor

sute de specii. Ele au fost izolate de sursele naturale ?i ameliorate prin

intermediul mutagenezei induse ?i selec?iei ulterioare a caracterelor

utile. Pentru antrenarea poten?ialului genetic al unui num?r tot mai mare

de microorganisme, la construirea tulpinilor industriale sunt utilizate

atвt microorganismele «de model», cвt ?i tulpinile folosite оn industria

microbiologic?.

Оn calitate de model de baz? se utilizeaz? cunoscutul bacil coli,

mul?umit? c?ruia biologia molecular? modern? a atins ni?te culmi

nemaiv?zute; de el ?in ?i primele succese importante оn domeniul

biotehnologiei ?i ingineriei genice.

Exist? tulpini de bacili coli produc?tori de hormoni (somatostatin?,

somatotropin?, insulin? ?. a.), de aminoacizi (treonin?, prolin?,

homoserin? ?. a.), de diferi?i interferoni ?. a.

Printre tulpinile utilizate оn industria microbiologic? men?ion?m оn

primul rвnd drojdiile, bacilii, ciupercile inferioare, actinomicetele ?. a.

Ele toate produc substan?e variate de mare valoare biologic?. Men?ion?m c?

оn prezent 70% din antibiotice se produc numai cu ajutorul actinomicetelor.

Este cea mai mare subramur? a industriei microbiologice mondiale, care

aduce un venit anual de 8-9 miliarde de dolari.

Bacteriile de genul pseudomonas con?in plazmide purt?toare ale genelor

degrad?rii biologice a compu?ilor organici, inclusiv a acelora care nu se

оntвlnesc оn natur? (de exemplu, pesticidele), fapt ce deschide mari

perspective оn utilizarea lor pentru protec?ia mediului ambiant.

Selectarea tulpinilor de microorganisme cu оnalt? productivitate a

ob?inut оn unele decenii mari succese pe baza realiz?rilor multor ?tiin?e.

Geneticiienii ?i selec?ionatorii, utilizвnd pentru provocarea muta?iilor

mutagenele chimice ?i radia?iile ionizate, au ob?inut noi tulpini care

оntrec ca productivitate de 100 ?i chiar de mai multe ori formele ini?iale.

Dac? penicilina a devenit оn prezent accesibil? fiec?ruia, aceasta se

explic?, оn primul rвnd, prin faptul c? selec?ionatorii au crescut o

cultur? de microorganisme cu o capacitate de 20-25 mii de unit??i la un

mililitru cub de mediu, оn loc de 100 de unit??i, ob?inute la tulpinile

ini?iale. Conform opiniei lui S. Alihanean, aceasta оnseamn? c? оn loc de

200 de fabrici de penicilin? este destul s? avem doar una singur?.

Prin metoda conjug?rii la pseudomonade a fost realizat? cu succes

transferarea genelor ?i construit? o tulpin? ce are drept surs? de carbon

unul din cei doi componen?i ai «substan?ei de oranj» - un defoliant toxic

pentru oameni, folosit pe larg de SUA оn r?zboiul din Vietnam. Aducem оnc?

un exemplu despre geneticiienii ?i selec?ionatorii care оn colaborare cu

inginerii genici «domesticesc» microbii ?i creaz? pentru industrie noi

tulpini cu caractere proiectate. Este vorba despre crearea de c?tre

savan?ii Institutului de cercet?ri ?tiin?ifice оn domeniul geneticiii ?i

selec?iei microorganismelor industriale (IUC?) a unei tulpini noi de

bacterii produc?toare de treonin?.

Treonina, la fel ca ?i lizina, este necesar? pentru оmbog??irea

nutre?urilor ?i produselor alimentare. Aminoacizii lizina, metionina,

treonina ?i izoleucina, оn ordinea оn care sunt prezentate aici, sunt

sintetizate de bacterii din acid asparagic. Aici se respect? ordinea

urm?toare: ca s? oprim sinteza, de exemplu, la etapa de lizin?, trebuie s?

оnchidem drumul pentru transform?rile continue ale acidului asparagic оn

metionin?, treonin? ?i izoleucin?. ?i atunci оn bacterie оncepe

suprasinteza, adic? producerea accelerat? a lizinei. Iar dac? este nevoie

de reducerea intens? a treoninei, trebuie blocat? transformarea ei continu?

оn izoleucin?.

Speciali?tii IUC? оn domeniul geneticiii microorganismelor, оn frunte cu

directorul s?u V. Debabov, au ales pentru efectuarea cercet?rilor lor

colibacilul de care ?in multe din succesele ob?inute оn ingineria genetic?.

Sectorul ADN al acestei bacterii, responsabil pentru sinteza treoninei

(acest sector poart? numele de operon), este compus din trei gene ?i din

regiunea reglatoare care le dirijeaz?. Acest operon codific? formarea a

patru fermen?i care transform? succesiv acidul asparagic оn treonin?, iar

apoi оn izoleucin?.

Cu pre?ul unor mari eforturi savan?ii au reu?it s? provoace muta?ii ale

genelor operonului, datorit? c?rora celulele mutante au оncetat a sintetiza

izoleucina, acumulвnd astfel mai mult? treonin?.

Dar ?i aceste celule sintetizau foarte pu?in? treonin?. Atunci оn ele a

fost inserat cu ajutorul fagului o gen? special?, al c?rei produs activiza,

la rвndul s?u, munca genelor responsabile pentru sintetizarea treoninei.

Dup? efectuarea acestei opera?ii celulele colibacilului au оnceput s?

elaboreze cвte 2-3 grame de treonin? la un litru de lichid cultural.

Оnceputul promitea multe, cu toate c? pentru a fi bun? pentru produc?ia

industrial? tulpina trebuia s? produc? cel pu?in de 10--15 ori mai mult

aminoacid de acest fel.

Ce se putea face? ?i aici speciali?tii ?i-au concentrat aten?ia asupra

uneia din particularit??ile foarte importante ale plazmidelor, care,

p?trunzвnd оn bacterie, оncepe s? se reproduc? repede ?i formeaz?, de

obicei, 15-20 de copii. Dac? оns? оn mediul cultural se introduce ?i

cloramfenicolul, оn celul? se opre?te sintetizarea proteinei ?i spore?te

brusc num?rul de copii ale plazmidei. Uneori ele ating cifra de 3000.

Tocmai acest fapt le-a sugerat savan?ilor cum s? procedeze оn acest caz.

Ini?ial, cu ajutorul fermen?ilor respectivi, ei au t?iat din cromozomul

tulpinii de bacterie ob?inute оnainte un fragment de ADN, care con?inea un

operon de tulpin? cu toate cele trei gene ale sale ?i cu sectorul de

reglare. Dup? aceasta, оn laboratorul de inginerie genic?, operonul a fost

inserat оntr-o plazmid?, iar ea - оntr-o alt? bacterie de aceea?i tulpin?.

Plazmida hibrid? s-a оnmul?it acolo ?i a intensificat sinteza treoninei. Оn

48 de ore de fermentare aceast? nou? tulpin? sintetiza aproape 20 grame de

treonin? la un litru de lichid cultural, iar cвnd au fost ameliorate

condi?iile de cultivare a tulpinii, оn 30 de ore au оnceput s? se acumuleze

aproape 30 de grame de treonin?.

Astfel a fost creat? pentru оntвia oar? оn lume o tulpin? industrial? de

microorganisme, care sintetizeaz? treonina, unul din aminoacizii cei mai

importan?i pentru cre?terea animalelor. Pentru оntвia oar? оn lume aceast?

tulpin? a fost ob?inut? printr-o metod? de construire a ingineriei genice

numai оn trei ani; separarea unor noi tulpini prin metodele tradi?ionale de

selectare dura zeci de ani.

11.4 Industria ADN ?i biotehnologia

Pe parcursul ultimilor ani ia na?tere o nou? ramur?, absolut nou?, de

produc?ie material? - biotehnologia, care utilizeaz? procesele ?i sistemele

biologice pentru a ob?ine cele mai diverse produse.

Oamenii au оnsu?it unele metode biotehnologice оnc? din timpurile

str?vechi. ?i procesele de fermenta?ie care permit ob?inerea produselor

acidolactice, pвinii, o?etului ?. a. fac parte din domeniul biotehnologiei.

Оn ultimele dou?-trei decenii, datorit? schimb?rilor radicale ce s-au

produs оn ?tiin?a biologic?, s-a ridicat la un nivel calitativ nou ?i

biotehnologia. Datorit? acestor realiz?ri omul poate azi nu numai s?

foloseasc? microorganismele «gata», dar ?i s? modifice programul genetic al

celulelor lor, s? le imprime caractere cu totul noi: tocmai оn aceasta din

urm? const? sarcina ingineriei genetice moderne.

Datorit? dezvolt?rii biologiei moleculare ?i ingineriei genice,

biotehnologia a devenit o metod? universal? de ob?inere оn orice propor?ii

a celor mai diverse substan?e organice, permi?вndu-ne s? renun??m la

procesele tehnologiei chimice care-s voluminoase ?i deseori pu?in eficace.

Savan?ii ?i-au concentrat aten?ia оn primul rвnd asupra problemelor de

sintez? a hormonilor, care, al?turi de vitamine, servesc drept reglori de

mare importan?? ai metabolizmului ?i ai multor procese fiziologice din

organismul omului ?i animalelor.

Moleculele hormonilor au dimensiuni mici. Structura multor dintre ele a

fost studiat? detaliat, dar sinteza lor chimic? s-a dovedit a fi prea

dificil? ?i scump?. Deaceea savan?ii au ales оn acest scop o alt? cale:

sintetizarea prin metod? chimic? nu a proteinei-hormon, ci a unei gene

incomparabil mai simple care codific? sintetizarea hormonului necesar. Dar

pentru aceasta gena trebuie inserat? оn componen?a moleculei recombinante

de ADN ?i, sub comanda ei, s? se organizeze оn bacterie sinteza biologic? a

unui hormon uman de valoare complect?.

Pentru prima dat? a fost creat? prin metoda aceasta tulpina bacteriilor -

produc?toare de somatostatin?. Acest hormon este produs de lobul anterior

al hipofizei ?i regleaz? secre?ia unei serii de al?i hormoni, inclusiv a

hormonului cre?terii, insulinei ?i glicogenului. Somatostatina utilizat? оn

practica medical? se ob?ine din hipofiza vitelor cornute mari. Оns? din

punct de vedere chimic ea se deosebe?te оntrucвtva de hormonul amului ?i de

aceea nu d? оntotdeauna rezultatul dorit.

Molecula somatostatinei este compus? din 14 aminoacizi. Un grup de

experimentatori de la Universitatea din California (SUA), оn frunte cu G.

Boyer, au sintetizat o gen? оn care a fost codificat? formarea

somatostatinei. Apoi cu ajutorul plazmidei savan?ii au inserat aceast?

gen? оntr-un colibacil. Оntr-un timp scurt bacteria a sintetizat un volum

mic de lichid cultural ce con?inea o cantitate de hormoni care, de obicei,

se extrage din hipofiza a sute de mii de tauri.

Somatostatina a g?sit de acum o larg? aplicare la tratamentul bolilor

pancreasului (pancreatitelor ?i diabetului), precum ?i a acromegaliei -

cre?terea ne propor?ional? a p?r?ilor proeminente ale corpului. Aceasta a

fost o mare victorie a ingineriei genice. Astfel a devenit real?

posibilitatea de a se ob?ine gene artificiale pentru ceilal?i hormoni ?i de

a deschide perspective ademenitoare pentru producerea celor mai diferite

proteine, precum ?i a altor produse. Aceste produse pot fi ob?inute оn

cantit??i nelimitate, ele vor fi ieftine ?i, ceea ce este ?i mai important,

ac?iunea lor nu se va deosebi de cea a hormonilor omului ?i a altor compu?i

biologici activi.

Оn lobul anterior al hipofizei omului ?i animalelor se sintetizeaz? оn

afar? de somatostatin? un оntreg buchet de hormoni de natur? proteic?,

printre care cel mai cunoscut este hormonul cre?terii sau somatotropina.

Dac? organismul оn cre?tere duce lipsa lui, apare nanismul, iar dac? оl

con?ine оn cantit??i prea mari, apare gigantismul. Despre participarea

acestui hormon la reglarea cre?terii s-a aflat оnc? la оnceputul secolului

XX. Оn anul 1921 cu ajutorul extractului hipofizei au fost crescu?i ni?te

?obolani gigan?i.

Hormonul cre?terii se con?ine оn hipofizele animalelor cornute mari ?i s-

ar putea extrage оn cantit??i necesare. Dar s-a constatat c? somatotropina

este un hormon specific pentru fiecare specie: оn organismul uman

somatotropina animalelor cornute mari nu este activ?. Omul are nevoie de

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30