|
Современная генетикаmetode – «hibridizarea ADN-ului» – premiza logic? a fost foarte simpl?: dac? la dou? organisme ADN-ul se aseam?n? mult, oare nu putem prin denaturarea ?i renaturarea lor comun? s? ob?inem formarea de molecule, care includ catene complementare din aceste molecule atвt de diferite, dar asem?n?toare. Оn componen?a unei molecule de ADN catenele opuse se deosebesc оntrucвtva dup? con?inutul nucleotidelor purine (A, G) ?i pirimidine (C, T) ?i, prin urmare, dup? masa lor molar?. Una dintre ele este «u?oar?» (U), iar cealalt? – «grea» (G). Schema experien?ei poate fi prezentat? astfel: ADN 1 (g, u) + ADN 2 (g, u) ( denaturare ( ADN 1 g + ADN 1 u + ADN 2 g + ADN 2 u ( renaturare ( ADN 1 (g, u) + ADN 1 G, 2 u + ADN 1 u 2 g + ADN 2 (g, u). Din aceast? schem? reiese c? la renaturare e posibil? atвt restabilirea moleculelor ADN de tip primar, cвt ?i la formarea moleculelor hibride de ADN. Ca rezultat s-a descoperit c? moleculele hibride se formeaz? u?or atвt оn timpul experien?elor cu ADN-ul de diferite tulpini ale acelea?i specii de bacterii (colibacilul), cвt ?i cu ADN-ul speciilor de bacterii оnrudite foarte apropiat. Cu cвt speciile sunt оnrudite mai apropiat оntre ele, cu atвt ap?reau mai des moleculele hibride de ADN. Оn prezent aceast? metod? a devenit foarte popular? ?i se aplic? оn laboratoarele din оntreaga lume. A?a dar, se poate conchide c? autenticitatea opiniilor despre gradul de оnrudire filogenetic? a organismelor pe baza analizei complecte a ADN-ului lor este mult mai mare decвt autenticitatea rezultatelor ob?inute prin compararea caracterelor lor fenotipice. Оn urma numeroaselor cercet?ri a devenit limpede c? la animalele ?i plantele superioare deosebirile оn structura ADN-ului sunt mai pu?in pronun?ate decвt la procario?i (bacterii, alge albastre), la plantele inferioare ?i la animalele nevertebrate. Dar nu este destul s? ?tim gradul de asem?nare ?i de deosebire conform structurii ADN-ului organismelor din diferite grupuri sistematice. Aceasta se оntвmpl? mai ales la eucario?ii superiori, care se caracterizeaz? prin structura mozaic? (exo-nintron?) a genelor. Оn leg?tur? cu aceasta trebuie оn primul rвnd s? se determine succesivitatea nucleotidelor оn partea func?ional? a genelor, dar nu оn genere оn ADN. Metodele de inginerie genic? au oferit poeibilitatea de a se analiza cu exactitate structura fin? a genelor. Deseori func?ionarea оn organism a unei gene construite depinde de cвteva nucleotide. Оn prezent, datorit? analizei restric?ionale, a devenit posibil a se determina succesivitatea exact? a nucleotidelor оn gene, adic? «a citi» structura lor primar?. Dac? cunoa?tem succesiunea genei, atunci putem determina cu u?urin?? succesiunea aminoacid? a proteinei codificate de ea; оn prezent adesea este mai simplu a se determina structura primar? a proteinei pe aceast? cale indirect? decвt cu ajutorul secven?rii directe, adic? prin descifrarea succesiunii aminoacizilor оn proteine. Dac? determinarea succesiunii aminoacide a proteinei dureaz? luni ?i chiar ani оntregi, apoi оn prezent se reu?e?te a secveniza ADN-ul оn cвteva s?pt?mвni. Importan?a acestei metode pentru ingineria genic? ne-o demonstreaz? faptul c? savantul american U. Hilbert, autorul ei a fost distins cu premiul Nobel. Оn prezent experimentatorul poate citi cвte 1000 –5000 de nucleotide pe zi. Prelucrarea ?i analiza multilateral? a acestei cantit??i de informa?ie este deseori imposibil? f?r? ma?ina electronic? de calcul (MEC), care a devenit un aparat indispensabil al laboratorului de inginerie genic?. MEC poate de asemenea prezenta, ?inвnd cont de succesiunea nucleotidelor, specificul proteinei, pe care оl va produce aceast? gen?. Toat? aceast? informa?ie ma?ina o p?streaz? оn memoria sa. Exist? cвteva centre ?tiin?ifice, unde se p?streaz? informa?ia cu privire la structura primar? a genelor. Ce creeaz? o banc? de succesiuni nucleotide, оnzestrate cu o puternic? MEC. Asemenea b?nci exist? ?i оn multe ??ri str?ine. Ele toate sunt unite printr-un sistem mondial unic, pentru ca оn orice moment s? se poat? ob?ine informa?ia despre anumite gene. Astfel ingineria genic? aduce nu numai un aport important la cercet?rile fundamentale оn domeniul biologiei moleculare, ci contribuie totodat? la elaborarea unor aspecte practice ?tiin?ifice de mare importan??, inclusiv ale sistematicii. 15.3 Realiz?rile ?i perspectivele genosistematicii Care sunt rezultatele practice ob?inute de genosistematic?? Cercet?ri ce au avut un scop practic bine definit au fost оncepute de I. Blohina la Institutul de cercet?ri ?tiin?ifice оn domeniul epidemiologiei ?i microbiologiei din Gorchii Mai tвrziu la acest institut a fost creat primul laborator specializat, care solu?ioneaz? probleme importante de microbiologie ?i epidemiologie practic?. Rapiditatea ?i exactitatea sunt avantaje ale metodelor genosistematice de identificare a microbilor. Ele au mare importan?? atunci cвnd propriet??ile microbului sunt denaturate оn urma contactului cu preparatele medicamentoase sau оn urma variabilit??ii ne ereditare obi?nuite. Aceste variabilit??i lezeaz? prea pu?in programul, dar оn complexul caracterelor fenotinului aduc tr?s?turi care denatureaz? «portretul» microbului, f?cвndu-l de ne recunoscut. Iat? un exemplu din practic?. Оn una din taberele de pionieri din Crimeia copiii au оnceput a avea tulbur?ri gastrointestinale. Prin metodele obi?nuite nu s-a putut determina cu exactitate agentul patogen. Medicii au fost nevoi?i s? recurg? la experien?e de hibridizare molecular? a ADN-ului. Ele au dat rezultate univoce, care au permis a se identifica microbul ?i a se lua m?suri antiepidemice. Metoda de hibridizare a ADN-ului s-a dovedit a fi foarte util? pentru sistematica microorganismelor. Mult timp savan?ii nu erau siguri de existen?a unor grupuri de microbi. Pe baza comunit??ii caracterelor lor fenotipice, cocii, lactobacilii, vibrionii ?i multe alte grupuri, dup? cum s-a constatat, includeau specii ne оnrudite. Printre numeroasele specii de microbi exist? ?i un grup de bacterii luminiscente, al c?ror loc оn sistematic? este determinat foarte vag. Оn anii 1965-1969 lucr?torii ?tiin?ifici ai vasului marin «Viteazi» au separat din apa marin? 50 de tulpini ale acestor microbi. Multe din ele n- au putut fi determinate prin metodele cunoscute conform caracterelor lor fenotipice. Savan?ii au hot?rвt s? fac? analiza ADN-ului. Ea a ar?tat c? dintre tulpinile separate 5 fac parte dintr-o nou? specie de bacterii luminiscente, numit? fotobacterium belozerschii, mo?tenind numele unuia dintre fondatorii genosistematicii. Utilizarea criteriilor geneticiii moleculare a scos din impas sistematica contemporan? a microorganismelor. Experien?ele asupra ADN-ului au permis examinarea de pe pozi?ii noi a locului pe care оl ocup? оn sistematic? multe plante ?i animale superioare. Speciile de grвu, de exemplu, aproape nu se deosebesc dup? componen?a ADN- ului atвt оntre ele, cвt ?i оntre speciile din genurile apropiate egilops, secar?, orz. Totodat? ADN-ul diferitelor specii de crin, ceap? adeseori nu se aseam?n? dup? structur?. Pentru separarea genurilor, familiilor, oridinelor ?i a grupelor sistematice mai superioare e nevoie de o apreciere obiectiv? a distan?ei genetice dintre ele, a gradului de divergen?? a genotipurilor care formeaz? speciile lor. Ce poate oferi genosistematica оn scopul solu?ion?rii acestei probleme dificile? Toate cercet?rile оn care se folose?te metoda de hibridizare a ADN-ului au condus la aceea?i concluzie: partea succesiunilor omologice (identice) a nucleotidelor оn ADN scade pe m?sur? ce compar?m оntre ele speciile cu un grad tot mai mic de rudenie filogenetic?. La speciile din diferite clase de animale vertebrate, de obicei, se poate g?si оn ADN 5–15% de succesiuni omologice de nucleotide, la speciile din diferitele ordine de aceea?i clas? – de la 25 pвn? la 40% ?. a. m. d., inclusiv pвn? la speciile de acela?i gen, care deseori nu pot fi recunoscute. Aceste aprecieri cantitative ale asem?n?rii materialului genetic pot fi utilizate оn solu?ionarea cazurilor discutabile, atunci cвnd diferi?i sistematicieni apreciaz? оn mod diferit rangul taxonului. De exemplu, majoritatea sistematicienilor divizeaz? оn prezent pe?tii оn dou? clase: pe?ti cartilagino?i ?i pe?ti oso?i. Dup? ce a fost hibridizat ADN-ul rechinului cu ADN-ul crapului, somnului, gorbu?tei ?i nisetrului, s-a constatat o mare neasem?nare: au fost g?site doar aproape 10% de omologii, fapt ce confirm? teza cu privire la dep?rtarea ce exist? оntre aceste dou? grupuri de pe?ti. S-au dovedit a fi nea?teptate, оns?, rezultatele hibridiz?rii ADN-ului pe?tilor oso?i: partea omologiilor оn ADN-ul nisetrului pe de o parte ?i a reprezentan?ilor a trei subordini diferite – costr??ului, crapului, somonului – pe de alta, a fost de asemenea mic? – aproape 10%. Pe baza acestor rezultate s-a tras concluzia c? este ra?ional ca sturionii s? fie extra?i din clasa pe?tilor oso?i ?i s? alc?tuiasc? o clas? independent?, precum considera pe timpuri ?i A. N. Sever?ev. Astfel metodele ingineriei genice fac posibil? studierea evolu?iei moleculare a lumii vegetale ?i lumii animale, precum ?i a regnului microorganismelor. Ele pot fi de mare ajutor la solu?ionarea unei serii de probleme ce ?in de arheologie, de evolu?ia omului, de dezvoltarea ?i migra?ia popoarelor. Aceast? posibilitate o confirm? ?i comunicarea senza?ional? f?cut? nu demult de c?tre savantul suedez S. Paabo de la Universitatea Uppsala despre clonarea reu?it? a ADN-ului extras din r?m??i?ele mumiei unui copil egiptean, care a tr?it aproape 2400 de ani оn urm?. Autorul cercet?rii a оncercat s? separe ADN-ul din dou?zeci ?i trei de diferite mumii, dar numai оntr-un singur caz a avut noroc. Din pulpa stвng? a unui prin? egiptean balzamat оn vвrst? de un an, ce se p?stra la muzeul din Berlin, el a extras cвteva celule. Din acestea a separat un fragment de ADN, pe care l-a inserat оntr-o plazmid? bacterian? ?i l-a оnmul?it. Оn articolul publicat оn revista «Nature» din aprilie 1985 autorul a prezentat succesiunea complect? a fragmentului clonat de ADN ce con?inea aproape 3400 de nucleotide. S-a constatat c? fragmentul de ADN studiat a r?mas nev?t?mat оn timpul mumifierii, p?str?rii ?i nu ?i-a pierdut func?iile genetice. A?a a fost dovedit? posibilitatea separ?rii ?i studierii fragmentelor de ADN str?vechi. Clonarea ?i descifrarea ADN-ului din r?m??i?ele ce s-au p?strat ale oamenilor (ele se оntвlnesc nu numai оn Egipt, ci ?i оn Peru, Japonia, Australia, Europa) deschid arheologilor perspective captivante. Compararea succesiunilor nucleotidice permite doar determinarea rudeniei genetice. Оn viitor noua metoda va fi utilizat? la solu?ionarea numeroaselor enigme, ce stau оn fa?a arheologilor cu privire la originea ?i migra?iile str?mo?ilor no?tri. Ea va oferi posibilitatea de a se determina cu un mare grad de precizie vвrsta biologic? a speciei umane ?i a rudelor ei apropiate. Datele moderne, ob?inute cu ajutorul metodelor ingineriei genice, au permis s? se fac? o precizare esen?ial?: omul a оnceput s? se deosebeasc? de ruda sa cimpanzeul numai cu 5 milioane de ani оn urm?, nu cu 8 milioane, cum se presupunea оnainte. S-a descoperit c? 98% din materialul genetic al cimpanzeului este identic cu cel al omului ?i numai 2% din acesta se deosebe?te. Cunoa?terea legit??ilor dezvolt?rii evolutive (istorice) a tot ce este viu pe P?mвnt prezint? o importan?? colosal?. Ea confirm? caracterul material al lumii organice din jurul nostru, dezv?luie baza dialectic? a dezvolt?rii ei. Bazвndu-se pe datele genosistematicii, putem prevedea calea de mai departe a evolu?iei vie?ii pe P?mвnt ?i, prin urmare, metodele de dirijare ?i orientare ale ei. Cunoa?terea rudeniei filogenetice dintre diferitele grupuri de organisme ne ofer? un instrument minunat de modificare a formelor existente, de reconstituire a unor specii de plante ?i animale disp?rute ?i de creare a unora noi. XVI. INGINERIA GENETIC? ?I MEDICINA 16.1 Povara genetic? оn societatea uman? «Minte s?n?toas? оntr-un corp s?n?tos» – spune proverbul antic. ?i nu оntвmpl?tor oamenii о?i doresc оn primul rвnd s?n?tate. Fericirea familiei depinde ?i ea оn mare parte de s?n?tatea copiilor. Numeroasele boli de care sufer? oamenii au cauze diferite. Dac? boala pruncului este provocat? de ac?iunea unor factori nefavorabili asupra organismului f?tului, ea se consider? neereditar?, dobвndit?. Dac? ea a fost determinat? de genele defectate ale p?rin?ilor, ea este ereditar?. Medicina modern? se achit? u?or cu bolile dobвndite. Ea a cв?tigat lupta cu epidemiile de pest?, de variol?, de holer?, care оn trecut secerau mii de vie?i omene?ti. Ea lupt? cu mai mult succes contra tuberculozei, pneumoniei, dizenteriei ?i numeroaselor boli de copii. Cвt prive?te bolile ereditare, situa?ia este alta, deoarece оn aceste cazuri оl putem trata par?ial pe bolnav, dar nu putem lichida boala, c?ci deocamdat? nu e posibil? prevenirea transmiterii ei genera?iei ulterioare. De aceea, cвnd оn familie un copil e bolnav din n?scare, p?rin?ii vor s? ?tie dac? urm?torul prunc o s? fie s?n?tos sau оl amenin?? aceea?i soart?. Incertitudinea оl sile?te s? se ab?in? de la procreare, s? recurg? la оntreruperea artificial? a sarcinii ?. a. Acestea duc la traume psihice grave ?i deseori sunt cauze de destr?mare a familiei. Conform calculelor efectuate de diferi?i savan?i, 7–10% din num?rul total al oamenilor au devieri de la norma biologic?. Mai mult chiar, avem impresia c? bolile ereditare sunt оn cre?tere. Acest lucru este determinat de multe cauze, ?i оn primul rвnd de poluarea global? a mediului ambiant. Odat? cu dezvoltarea industriei ?i tehnicii оn ora?e ?i cu industrializarea ?i chimizarea produc?iei agricole, оn mediul ambiant a ap?rut o mare cantitate de agen?i mutageni, care provoac? modific?ri ereditare – muta?ii. Frecven?a muta?iilor poate spori mult datorit? cre?terii fonului artificial al radia?iei, ac?iunii mutagenilor chimici ?i a multor pesticide. Оn prezent sunt cunoscu?i aproape 2000 de compu?i chimici cu un efect mutagenic. S-a mai constatat c? unele preparate medicamentoase, dac?-s folosite prea mult, pot avea ?i ele rol de mutageni. Utilizarea f?r? control a medicamentelor, fumatul ?i consumul alcoolului de c?tre femeile gravide exercit? o influen?? negativa asupra dezvolt?rii f?tului. Din aceast? cauz? atвt la femei, cвt ?i la b?rba?i deseori se formeaz? game?i de valoare genetic? incomplet?. Agen?ii mutageni de origine fizic? ?i chimic? provoac? modificarea genelor, cromozomilor ?i a unor оntregi genomi atвt оn celulele sexuale, precum ?i оn celulele somatice. Din cauza tulbur?rilor aparatului genetic al celulelor sexuale, ele о?i pierd vitalitatea ?i nu pot participa la fecundare sau produc zigo?i, embrioni ?i fe?i de valoare incomplet?, cu vitalitate sc?zut?, care sunt elimina?i la diferite etape de embriogenez? ?i dezvoltare postembrionar?. Dac? muta?iile nu exercit? nici o influen?? asupra vitalit??ii, ele conduc la dezvoltarea bolilor ereditare care au forme diferite ?i care, luate оn ansamblu, creeaz? a?a-zisa povar? muta?ional? sau genetic? (ereditar?) оn popula?iile omului. Оn unele ??ri s-a f?cut o statistica foarte trist?. Оn SUA, de exemplu, numai jum?tate din 5–10 milioane de gravidit??i ating maturitatea, cealalt? jum?tate se sfвr?esc cu pieirea embrionilor оn etapele precoce de dezvoltare. Din 3,2 milioane de embrioni, care au atins vвrsta de 20 de s?pt?mвni, 40 de mii pier, f?r? a dovedi s? se nasc?. Tot atв?ia prunci mor оn prima lun? dup? na?tere din cauza unor defecte, alte 40 de mii r?mвn оn via??, avвnd vicii congenitale, care uneori pot fi tratate. Оn fiecare an se nasc aproximativ 90 mii de copii deficien?i mintal ?i 150 de mii care vor оnv??a cu greu. Care sunt cauzele acestor nenorociri? Principala se con?ine оn genele ?i cromozomii defecta?i care se transmit prin ereditate. Fiecare om care pare s?n?tos are оn aparatul cromozomic al celulelor sale cel pu?in 12 gene defectate, care pвn? la un anumit timp nu se manifest?, deoarece se afl? оn stare heterozigot?. Оns? atunci cвnd aceste gene recisive mutante sunt introduse оn zigotul simultan ?i de gameta masculin? ?i de gameta feminin?, ele trec оn stare homozigot? ?i conduc la dezvoltarea unei boli ereditare. ?tiin?a cunoa?te peste 2000 de boli ereditare ale omului ce ?in de muta?iile unor gene aparte ?i aproape 500 de boli, ce ?in de tulburarea structurii sau num?rului cromozomilor. Ele, independent de voin?a noastr?, se transmit genera?iilor viitoare, dac? medicina nu va interveni la etapa embrionar? de dezvoltare a acestor boli. Prezint? interes urm?toarele date. Frecven?a muta?iilor cromozomice la avorturile medicale (cu scopul regl?rii natalit??ii) nu dep??e?te 2%, la avorturile spontane ea constituie 20–25%. Оn primele 10 s?pt?mвni de graviditate ea atinge 50%, iar la 6 s?pt?mвni – 70%. Aceste date demonstreaz? c? dac? оn garnitura cromozomic? a embrionilor intervin mai multe tulbur?ri, atunci fe?ii sunt elimina?i mai repede. De aceea putem presupune c? majoritatea absolut? a zigo?ilor cu tulbur?ri mai complicate ale cromozomilor este eliminat? imediat dup? ce a fost conceput? sau оn cele dou?-trei s?pt?mвni ce urmeaz? dup? ea. Ei scap? din cвmpul de vedere al medicilor ?i nu sunt examina?i de c?tre ace?tia. A?a dar, pieirea intrauterin? a game?ilor, zigo?ilor ?i embrionilor de valoare genetic? incomplet? constituie un mecanism de selec?ie la om. Dac? n-ar exista ac?iunea de eliminare a selec?iei naturale la etapa embrionar? de dezvoltare, num?rul bolilor ereditare ar fi foarte mare. Acesta e rolul profilactic al selec?iei embrionare. Sunt descrise multe boli, care se transmit stabil prin ereditate. Printre ele cit?m – surdomu?ia, podagra, ?izofrenia, hemofilia, daltonismul, albinismul (pielea ?i p?rul sunt incolore, ochii trandafirii), boala oaselor de marmor? (fragilitatea oaselor), unele forme de diabet, оnc?run?irea ?i chelia ?. a. Faptul c? unele boli se transmit prin ereditate se cuno?tea demult. Astfel оn 1716 lui Edvar Lambert, fiu al unor p?rin?i s?n?to?i, a оnceput a i se оntuneca repede pielea ?i apoi s-a acoperit cu solzi?ori. Edvar a avut 6 fii, care au avut ?i ei piele de porc ghimpos. Acest semn s-a repetat la ?ase genera?ii posterioare de b?ie?i. Istoria cunoa?te cazuri de transmitere prin ereditate a cecit??ii nocturne congenitale, care au mo?tenit-o 134 de urma?i ai unui neam de elit? pe parcursul mai multor genera?ii. Regii germani din dinastia Habsburgic?, care au cвrmuit оntre anii 1273–1918, la оnceput оn Sfвntul Imperiu roman, apoi оn Spania, Austria ?i, оn sfвr?it, оn Austro-Ungaria, aveau falca de jos proeminent? ?i buza de jos deformat? оn mod specific. Mo?tenirea acestor caractere s-a studiat foarte am?nun?it, rezultatele au fost publicate оmpreun? cu portretele istorice de Academia imperial?, care se afla sub auspiciile familiei Habsburgilor. Dac? privim portretul unui membru al familiei din secolul XIV ?i portretul unui urma? din secolul XIX, vom vedea c? acest semn, buza habsburgic?, se transmitea din genera?ie оn genera?ie ?i se reproducea cu exactitate. Articula?iile, oasele, cartilagiile, ligamentele con?in ni?te glucide numite mucopolizaharide. Dac? metabolismul lor este tulburat, copiii r?mвn оn dezvoltarea lor intelectual? ?i fizic?. Cre?terea lor оncetine?te brusc, li se deformeaz? cutia toracic? ?i membrele, deseori le cre?te un gheb. Se presupune c? Nicollo Paganini a suferit de o astfel de boal?. Geneticiienii contemporani au g?sit explica?ia оnf??i??rii bizare a marelui violonist. Fa?a lui palid?, ochii enoftalmici, degetele supraelastice ?i extrem de lungi – ele toate sunt caracteristice pentru sindromul Marfan – o boal? ereditar?, descris? pentru prima dat? peste 56 de ani dup? moartea lui Paganini. Virtuozitatea interpret?rii lui Paganini se explica prin structura neobi?nuit? a degetelor. Bineоn?eles, plus talentul s?u muzical. Оn anul 1866 neuropatologul englez L. Down a descris pentru prima dat? o boal? congenital?, care afecta оn mediu unul din 600 de prunci. Copiii bolnavi erau indolen?i, cu limba groas?, stвngace, cu nasul turtit, cu fa?a palpebral? оngust?. Deseori sufereau de leziuni valvulare cardiace congenitale ?i оntotdeauna erau deficien?i mintal. Mul?i dintre ei alc?tuiau contingentul spitalelor de psihiatrie. Aceast? boal? a fost numit? boala lui Down, mo?tenind numele medicului care a descris-o. Adev?rata ei cauz?, оns?, a fost descoperit? de savantul francez J. Legen. El a studiat la microscop multe celule luate de la copiii bolnavi ?i a descoperit c? ele оn loc de 46 de cromozomi au 47. Cromozomul de prisos se afl? оn perechea 21. De aceea aceast? tulburare mai poart? numele ?i de trizomia-21. Odat? cu оnaintarea оn vвrst? a mamei, spore?te pericolul na?terii unor astfel de copii. La femeile оntre 19–21 ani un «daun» se na?te la 2500 de copii, iar la femeile de 45 de ani – unul la 40. Bolnavii cu sindromul «daun» tr?iesc cвteva zeci de ani. Tratamentul este ineficient. Uneori ei pot fi оnv??a?i s? citeasc? ?i s? scrie. O alt? boal? cromozomic? este sindromul Edvards, provocat? de neconcordan?a cromozomilor оn perechea 18. El este оntotdeauna mortal. Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 |
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
Рефераты бесплатно, реферат бесплатно, сочинения, курсовые работы, реферат, доклады, рефераты, рефераты скачать, рефераты на тему, курсовые, дипломы, научные работы и многое другое. |
||
При использовании материалов - ссылка на сайт обязательна. |